Isolement, caractérisation et Purification des Macrophages dans les tissus touchés par l’Inflammation associées à l’obésité

Modèles de souris ont été largement utilisés pour étudier la dynamique des maladies humaines. Isolation correcte des cellules résidentes des souris dans un état de malade peut fournir une plate-forme pour comprendre les contributions moléculaires et cellulaires à la pathogenèse de la maladie¹. Un trouble qui est d’une importance cruciale est l’obésité. L’incidence de l’obésité continue d’augmenter dans le monde entier en parallèle avec la résistance à l’insuline et le type 2 mellitus de diabète, maladies cardiovasculaires et stéatose hépatique^2,3. Une consommation excessive en éléments nutritifs est plus biaisée par la diminution de l’activité physique déclenchant des signaux altérés provenant du tissu adipeux, ce qui peut modifier le milieu cellulaire des autres tissus périphériques tels que l’ aorte et le foie⁴. Ces perturbations de l’homéostasie métabolique se traduit par une inflammation systémique de chroniques de bas grade⁵.

Classique activation des macrophages résidents à l’aorte et du foie ainsi que leur recrutement dans le tissu adipeux blanc (WAT) s’est avérée non seulement lancer le dérèglement des signaux métaboliques mais également soutenir l’inflammation^6,7. L’hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle des macrophages est fortement liée à la pathogenèse de l’obésité des comorbidités⁷. La plasticité dynamique en polarisation macrophage permet ces cellules présentent un éventail des phénotypes activés qui coordonnent la progression et la résolution de l’inflammation,⁸. Tandis que les macrophages activés de façon classique (M1) sont impliqués dans la propagation de l’inflammation, alternativement activés macrophages (M2) ont été associés à la résolution et le tissu réparation^9,10.

Comme le corps subit des stress métabolique, le tissu adipeux blanc s’accumule anormalement. Le tissu adipeux élargi attire et retient les cellules inflammatoires qui modifient profondément les fonction d’adipocyte normal pour favoriser la résistance à l’insuline, hyperglycémie et diabète de type 2 en fin de compte, insulinorésistance ou hyperglycémie^{11, 12}. En parallèle, le tissu adipeux blanc remodèle en réponse à des signaux inflammatoires libérés par infiltré classiquement activés (M1) du tissu adipeux macrophages (ATMs)^13,14. Cet organe multicellulaire exerce une cascade de signaux qui déraille la fonction normale des autre organes du corps humain tels que l’aorte et du foie⁴.

Le foie est un puissant métabolique qui s’adapte en réponse à des stimuli provenant du voisin dysrégulation WAT¹⁵. Macrophages hépatiques ou des cellules de Kupffer, en réponse à des changements métaboliques, sécrètent des cytokines inflammatoires qui transforment les deux parenchymateuses et phénotype cellulaire non parenchymateuses et promouvoir le remodelage tissulaire. Accumulation de lipides hépatiques, inflammation, dépôts excessifs de la matrice extracellulaire, nécrose et fonction éventuelle perte suit les insultes inflammatoires qui contribuent à la vaste gamme d’atteinte hépatique associées non alcoolisées stéatose hépatique ^16,17,18.

Parallèlement au WAT compromise et la fonction hépatique, grosses artères s’accumulent des lipides dans la paroi artérielle que le corps subit un stress métabolique chronique¹⁹. Accumulation de lipides artérielle déclenche la sécrétion de chimiokines par les cellules endothéliales activées et le recrutement des monocytes²⁰. Une fois recrutés, monocytes prolifèrent, se différencient, ingèrent des lipoprotéines et deviennent des cellules spumeuses. Athérogenèse est initiée et soutenue par l’activité pro-inflammatoire des recrutés et les tissus résident macrophages chargés de lipides. Succomber aux signaux extracellulaires et intracellulaires stress relayés dans ce micro-environnement athérogène, ces macrophages puis s’engager dans une apoptose cascade de signalisation. Comme ces cellules meurent, elles contribuent à leur teneur en lipides rempli au noyau nécrotique de la lésion, ce qui mène à la rupture de plaque, infarctus du myocarde et accident vasculaire cérébral.

Collectivement, l’hétérogénéité des phénotypes macrophage orchestre en partie l’obésité induite par les changements inflammatoires observées dans les tissus de dysrégulation tels que WAT, foie et aorte^8,21. Caractérisation des recrutés et macrophages résident tissulaires pourraient donner un aperçu de potentielles cibles moléculaires qui manipulent des macrophages phénotype¹. Afin de caractériser efficacement les macrophages des tissus enflammés induites par l’obésité, une suspension de cellules individuelles peut être obtenue par digestion enzymatique. Ces protocoles de dissociation doivent être efficaces dans la dégradation suffisamment de tissu conjonctif tout en minimisant la mort des cellules immunitaires et fournir le rendement cellulaire optimal. Le mélange d’enzymes est dépendant du type de tissu et son maquillage structurelle. Tissus résistants tels que l’aorte nécessite plus forte activité enzymatique, par rapport au foie et WAT, pour atteindre la dissociation tissulaire. De la suspension monocellulaire, macrophages résident tissulaires peuvent être sans ambiguïté caractérise ou isolés pour approfondir les analyses en aval comme le profilage transcriptionnel.

Ici est décrit un protocole tissu-spécifique qui utilise la digestion de collagénase dépendant des tissus et cytométrie polychromatique pour effectivement isoler et de caractériser des macrophages de tissu-résident provenant du régime alimentaire traditionnel induites par l’obésité, l’athérosclérose, simple stéatose et stéato-hépatite modèles murins. Simultanée de la coloration des marqueurs de surface de cellules avec des anticorps dirigés contre les leucocytes-(CD45 et/ou CD11b) et macrophage – antigènes spécifiques (F4/80) est souvent utilisé pour identifier les populations de macrophage²². Cellule activée par fluorescence triant (FACS) est une stratégie puissante permet de trier ces populations identifiées à haute pureté. La population triée peut ensuite être évaluée pour profils de gènes spécifiques de phénotype à l’aide de l’analyse moléculaire en aval (par exemple la PCR quantitative en temps réel)²³. Bien que standard cytométrie en flux et tri de cellule axée sur la cytométrie en flux sont des outils puissants pour distinguer les macrophages dans une suspension de cellules très hétérogène, anciens protocoles doivent être optimisés pour assurer une sortie réussie. Dans cette étude, les protocoles qui effectivement isoler et caractérisent les macrophages des tissus viables sont décrits ; plus important encore, cette étude donne un aperçu crucial de questions techniques qui se posent souvent, ainsi que des stratégies proactives et dépannage afin d’éviter et/ou de les résoudre.