Aislamiento, caracterización y purificación de los macrófagos de los tejidos afectados por la inflamación relacionados con la obesidad

Modelos de ratón se han utilizado para estudiar la dinámica de enfermedades humanas. Correcto aislamiento de las células residentes del tejido de los ratones en un estado enfermo puede proporcionar una plataforma para la comprensión de las contribuciones moleculares y celulares en la patogenia de una enfermedad¹. Un trastorno que es de vital importancia es la obesidad. La incidencia de la obesidad sigue aumentando en todo el mundo en paralelo con la resistencia a la insulina y tipo 2 mellitus de la diabetes, enfermedad cardiovascular y enfermedad del hígado graso^2,3. Consumo excesivo de nutrientes es más sesgado por disminución de la actividad física provocando señales alteradas provenientes del tejido adiposo, que puede alterar el medio celular de otros tejidos periféricos como el hígado y aorta⁴. Tal interrupción de la homeostasis metabólica resulta en una inflamación sistémica crónica de bajo grado del⁵.

Activación clásica del residente a la aorta y el hígado, así como su contratación al tejido adiposo blanco (WAT) de macrófagos ha demostrado no sólo iniciar el dysregulation de señales metabólicas sino también sostener la inflamación^6,7. La heterogeneidad fenotípica y funcional de los macrófagos está fuertemente asociada con la patogénesis de la obesidad relacionada con comorbilidades⁷. La plasticidad dinámica de polarización macrófagos permite para que estas células exhiben una variedad de fenotipos activados que coordinan la progresión y resolución de⁸de la inflamación. Mientras que clásico activados macrófagos (M1) están implicados en la propagación de la inflamación, macrófagos alternativamente activados (M2) se han asociado con resolución y el tejido de reparación^9,10.

Como el cuerpo somete a estrés metabólico, tejido adiposo blanco se acumula anormalmente. El tejido adiposo ampliado atrae y retiene las células inflamatorias que alteran profundamente la función del adipocito normal para promover la resistencia a la insulina, hiperglucemia y diabetes mellitus tipo 2 en última instancia, resistencia a la insulina o hiperglucemia^{11, 12}. En paralelo, remodelaciones de tejido adiposo blanco en respuesta a señales inflamatorias por infiltran clásico activado macrófagos (cajeros automáticos) de tejido adiposo (M1) de^13,14. Este órgano multicelular ejerce una cascada de señales que hace descarrilar la función normal de otros órganos del cuerpo tales como la aorta y el hígado⁴.

El hígado es una potencia metabólica que se adapta en respuesta a estímulos procedentes de cerca dysregulated WAT¹⁵. Macrófagos hepáticos o células de Kupffer, en respuesta a cambios metabólicos, secretan citoquinas inflamatorias que transforman tanto parénquima y fenotipo de la célula no parenquimales y promoción la remodelación tisular. Acumulación de lípidos hepáticos, inflamación, depósitos de matriz extracelular excesivo, necrosis y función eventual pérdida sigue los insultos inflamatorios contribuyendo a la amplia gama de daño hepático asociados con enfermedad del hígado graso no alcohólico ^1617,de^,18.

En paralelo a WAT comprometido y función hepática, arterias grandes acumulan lípidos dentro de la pared arterial como el cuerpo somete a estrés metabólico crónico¹⁹. Acumulación lipídica arterial desencadena la secreción de quimioquinas por las células endoteliales activadas y posterior reclutamiento de monocitos²⁰. Una vez reclutados, monocitos proliferan, diferencian, ingieren las lipoproteínas y se convierten en células espumosas. Aterogénesis es iniciada y sostenida por la actividad proinflamatoria de reclutados y macrófagos cargados de lípidos residente de tejido. Sucumbir a las señales de estrés extracelular e intracelular transmitidas en este microambiente aterogénico, estos macrófagos participan luego en una cascada de señalización de apoptosis. Como estas células espumosas mueren, contribuyen a su contenido de lípidos que llena a la base necrótica de la lesión, que entonces conduce a ruptura de placa, infarto de miocardio y accidente cerebrovascular.

Colectivamente, la heterogeneidad de los fenotipos de macrófagos organiza en parte la obesidad inducida por cambios inflamatorios en los tejidos normales como WAT, hígado y aorta^8,21. Caracterización de reclutados y macrófagos residentes pueden proporcionar la penetración en posibles dianas moleculares que manipulan macrófago fenotipo¹. Para caracterizar eficazmente los macrófagos de los tejidos inflamados inducida por la obesidad, una suspensión unicelular se puede obtener a través de la digestión enzimática. Tales protocolos de disociación deben ser eficaces en degradar suficientemente tejido conectivo mientras que minimiza la muerte celular inmune y proporciona rendimiento óptimo de la célula. La mezcla de la enzima es dependiente en el tipo de tejido y su maquillaje estructural. Tejidos resistentes como la aorta requiere mayor actividad enzimática, en comparación con el hígado y el WAT, para lograr la disociación del tejido. De la suspensión de la célula, macrófagos residentes pueden ser inequívocamente caracterizados o aislados para mayores análisis aguas abajo como perfilamiento transcripcional.

Aquí se describe un protocolo específico de tejido que utiliza tejido dependiente de colagenasa digestión y citometría de flujo policromáticos efectivamente aislar y caracterizar macrófagos residentes de tejido obtenidos de la dieta tradicional inducida por obesidad, ateroesclerosis, esteatosis simple y esteatohepatitis modelos de ratón. Simultánea de marcadores de superficie celular con anticuerpos contra leucocitos (CD45 o CD11b) y macrófagos – antígenos específicos (F4/80) es de uso frecuente para identificar a las poblaciones de macrófagos²². Celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación es una estrategia poderosa que se utiliza para ordenar estas poblaciones identificadas en alta pureza. La población clasificada puede evaluarse entonces perfiles de gen específico fenotipo mediante análisis molecular aguas abajo (por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa cuantitativo en tiempo real)²³. Aunque citometría de flujo estándar y clasificación de celda basados en citometría de flujo son herramientas poderosas en la distinción de macrófagos dentro de una suspensión sumamente heterogéneos, los protocolos anteriores deben optimizarse para asegurar la salida exitosa. En este estudio, se describen los protocolos que efectivamente aislaran y caracterizan los macrófagos específicos de tejido viable; más importante aún, este estudio proporciona penetración crucial en cuestiones técnicas que a menudo se presentan, así como de estrategias proactivas y solución de problemas para evitar o resolver.