Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade

Modelos de mouse têm sido extensivamente usados para estudar a dinâmica de doenças humanas. Isolamento adequado, residente de células de tecidos de ratos em um estado doente pode fornecer uma plataforma para a compreensão das contribuições moleculares e celulares para a patogênese de uma doença¹. Uma doença que é de importância crucial é a obesidade. A incidência de obesidade continua a aumentar em todo o mundo em paralelo com a resistência à insulina e o tipo 2 diabetes mellitus, doença cardiovascular e esteatose hepática^2,3. Consumo excessivo de nutrientes é ainda mais distorcido pela diminuição da atividade física, desencadeando alterados sinais provenientes do tecido adiposo, o que pode alterar o meio celular de outros tecidos periféricos como a aorta e fígado⁴. Tal rompimento da homeostase metabólica resulta em uma crônica de baixo grau de inflamação sistêmica⁵.

Clássica ativação de macrófagos residentes para a aorta e fígado, bem como o recrutamento para o tecido adiposo branco (WAT) tem demonstrada não só iniciar dysregulation do metabólicos sinais mas também sustentar inflamação^6,7. A heterogeneidade fenotípica e funcional de macrófagos é fortemente associada com a patogênese da obesidade relacionada co-morbidades⁷. A plasticidade dinâmica na polarização do macrófago permite que estas células que exibem uma variedade de fenótipos registrados que coordenam a progressão e a resolução da inflamação⁸. Enquanto classicamente ativados macrófagos (M1) estão implicados na propagação da inflamação, alternativamente ativados macrófagos (M2) foram associados com resolução e tecido reparação^9,10.

Como o corpo sofre estresse metabólico, o tecido adiposo branco anormalmente acumula. O tecido adiposo expandido atrai e retém células inflamatórias que alterar profundamente a função normal dos adipócitos para promover a resistência à insulina, hiperglicemia e, finalmente, diabetes mellitus tipo 2, resistência à insulina ou hiperglicemia^{11, 12}. Em paralelo, tecido adiposo branco remodela em resposta a sinais inflamatórios lançado pela infiltrou-se classicamente registrados (M1) tecido adiposo macrófagos (ATMs)^13,14. Este órgão multicelular exerce uma cascata de sinais que desvia a função normal de outros órgãos do corpo tais como a aorta e hepática⁴.

O fígado é uma potência metabólica que adapta-se em resposta aos estímulos provenientes da vizinha desregulação WAT¹⁵. Hepáticos macrófagos ou células de Kupffer, em resposta a alterações metabólicas, secretam citocinas inflamatórias que transformam ambos parenquimatosa e fenótipo de células não-parenquimatosas e promovem a remodelação do tecido. Acúmulo de lipídios hepático, inflamação, depósitos excessivos de matriz extracelular, necrose e função eventual perda segue os insultos inflamatórios, contribuindo para o amplo espectro de danos no fígado associados com doença hepática gordurosa não-alcoólica ^16,17,18.

Em paralelo a WAT comprometido e função hepática, grandes artérias acumulam lipídios dentro da parede arterial como o corpo sofre de estresse metabólico crônico¹⁹. Acúmulo de lipídios arterial desencadeia a secreção de quimiocinas pelas células endoteliais ativadas e subsequente recrutamento de monócitos²⁰. Uma vez recrutados, monócitos proliferam, diferenciam, ingerem lipoproteínas e tornar-se células de espuma. Atherogenesis é iniciada e sustentada pela atividade pró-inflamatória dos recrutados e macrófagos residentes tecido de lipídios-carregados. Sucumbir a sinais de estresse extracelular e intracelular, retransmitidos neste microambiente aterogênico, esses macrófagos então se envolver em uma cascata de sinalização de apoptotic. Como essas células espuma morrem, eles contribuem seu conteúdo lipídico preenchido para o núcleo necrótico da lesão, que então leva a ruptura da placa, infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral.

Coletivamente, a heterogeneidade dos fenótipos de macrófagos em parte organiza a obesidade induzida por alterações inflamatórias observadas nos tecidos de desregulação como WAT, fígado e aorta^8,21. Caracterização de recrutados e macrófagos residentes tecido poderiam fornecer insights sobre potenciais alvos moleculares que manipulam o macrófago fenótipo¹. Para efetivamente caracterizar os macrófagos dos tecidos inflamados induzida pela obesidade, uma suspensão de célula única pode ser obtida através de digestão enzimática. Esses protocolos de dissociação devem ser eficazes em suficientemente degradante do tecido conjuntivo, minimizando a morte celular imune e oferece um rendimento de célula ideal. A mistura de enzima é dependente do tipo de tecido e seu tornar-se estrutural. Tecidos resistentes, tais como a aorta requer mais forte atividade enzimática, em comparação com o fígado e o WAT, para alcançar a dissociação de tecido. Da suspensão de célula única, macrófagos residentes de tecido podem ser inequivocamente caracterizados ou isolados para ainda mais a jusante análises tais como criação de perfil transcricional.

Aqui um protocolo específico de tecido é descrito que usa tecido dependente de colagenase digestão e citometria de fluxo policromático efetivamente isolar e caracterizar macrófagos residentes tecido obtidos de obesidade dieta tradicional induzida, aterosclerose, simples esteatose e esteatohepatite mouse modelos. Simultânea de coloração de marcadores de superfície celular com anticorpos contra leucócitos-(CD45 e/ou CD11b) e macrófago – antígenos específicos (F4/80) é frequentemente usado para identificar as populações de macrófagos²². Fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação é uma poderosa estratégia usada para classificar essas populações identificadas em elevado grau de pureza. População classificada, então, pode ser avaliada para perfis de fenótipo gene específico usando a jusante análise molecular (tais como a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa)²³. Apesar de citometria de fluxo padrão e classificação de celulares baseados em citometria de fluxo são ferramentas poderosas na distinção entre macrófagos dentro de uma suspensão de células vastamente heterogêneos, os antigos protocolos devem ser otimizados para garantir uma saída bem sucedida. Neste estudo, são descritos os protocolos que efetivamente isolar e caracterizam os macrófagos específicos do tecido viável; mais importante, este estudo fornece insight crucial sobre questões técnicas que muitas vezes surgem, bem como estratégias proativas e resolução de problemas para prevenir e/ou resolvê-los.