Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Mikroglia c-kit + / CD45- ayırt mezodermal kökenli myb bağımsız yerleşik makrofajlar yolk kesesi ^{1, 2,} kan Adaları progenitörleri erythromyeloid bulunmaktadır. Embriyolojik mikroglia merkezi sinir sistemini (CNS) kolonileştiklerinde, bir dallanmış formda ^3'e bir amoeboid geçiş. Dinamik yansımaları potansiyel hakaretler ⁴ için sağlıklı beyin parankimi soruşturma beri Bunlar yetişkin mikroglia surveillant olarak sınıflandırılır. Mikroglia sadece MSS hücre nüfusunun yaklaşık% 10'una katkıda rağmen, kendi aralarında döşemek için yetenekleri parankimindeki ^{4, 5} maksimal tarama sağlar. Örneğin α-sinüklein ^{6, 7} ve amiloid-P ⁸ ya da p tehlikesi ile bağlantılı moleküler yapılar (DAMPS),lipopolisakarid (LPS) ile ⁹ olarak athogen ilişkili moleküler yapılar (PAMP), klasik amoeboid etkin duruma reversiyon ve nitrik oksit üretimi, tümör nekroz faktörü-α (TNFa), interlökin 1β ile vasıflandırılan enflamatuar bir tepki teşvik etmek mikroglia aktive (IL-1β), IL-6, IL-12 ve kemokin CC motifi ligandı 2 ^{9, 10, 11.} Patojenik α-sinüklein birikmiş olan Parkinson hastalığı gibi nöro koşullarında, bir nörodejeneratif döngüsü ayrıca mikroglia ⁷ klasik aktivasyonunu teşvik, daha birleşik α-sinükleinin serbest dopaminerjik nöronların ölümden oluşturulur. periferal makrofajlar benzer şekilde, mikroglia da alternatif olarak, anti-enflamatuar sitokinlerin IL-4 ve IL-10 varlığında aktive etme yeteneğine sahip onları etkili verecek şekilde olabiliriltihap ^{2, 11} sinir tamirinin geliştirilmesi ve hafifletme ial. Kenara CNS'de immünolojik rolleri, mikroglia gelişim sırasında sinaps budama nöronal devrenin hayati düzenleyicileri olarak tarif edilmiştir. Örneğin, Cx3cr1- KO fareleri, daha az yoğun mikroglia ve dendritik dikenler, olgunlaşmamış sinaps ve gelişmemiş bir CNS ¹² elektrofizyolojik desen bir çok artışına neden düşük sinaptik budama sahiptir. CNS homeostazında bu fizyolojik karmaşıklığını ve mikroglia farklı işlevsel roller anlama nörodejeneratif bozuklukların hedefleyen terapötikler araştırılmasında için çok önemlidir.

Nöroimmünoloji alanında, in vitro deneyler için mekanik çalışmalar için daha fizibilite yüksek ölçüde istenebilecektir, düşük bakım maliyeti, daha az zaman ve emek-yoğun olduğu için. Furthermoyeniden hücre popülasyonlarının izole edilmesi yeteneği öngörülen koşullar altında, bu hedef hücrelerin işlevini tarif etmek önemlidir. Çok sayıda mikrogliyal izolasyon yöntemleri mevcuttur, ancak bunlar geniş bir deney ^{13, 14, 15} için nispeten yüksek bir sayı ve saflık elde etme kabiliyetleri ile sınırlıdır. Örneğin, farklılaşma 11b, bir küme (CD11), monositler, makrofajlar, ve mikroglia ¹⁶ ortak bir yüzey markörüdür. CD11b yararlanarak, manyetik ayırma, bir yöntem, ilk olarak neonatal beyin ¹⁷ başına bir sütun tabanlı vermiştir yaklaşım ~% 99.5 saflık ve ~ 1.6 x 10 ⁶ mikroglia olarak tarif edilmiştir. Laboratuvar son zamanlarda fikoerıtrinle konjüge edilmiş bir monoklonal antikor (PE) CD11b etiketleyerek bir polistiren tüp içinde gerçekleştirilen bir kolonsuz CD11 manyetik ayırma yöntemi ^15, geliştirdi. Bir bispesifik secondary antikor PE ve PE ile dekstran kompleksleri. Bir kez bağlanmış, dekstran-kaplı manyetik parçacıklar antikor kompleksinin dekstran ucuna bağlama yapan, tanıtılmaktadır. Son olarak, polistiren tüp mikroglial izolasyonu için bir mıknatıs yerleştirilir. Bu yaklaşım için verim iki ~ neonatal beyin başına ancak ~% 97 saflıkta azaltılması pahasına 3.2 x 10 ⁶ mikroglia.

Burada, hızlı ve rafine kolonsuz CD11 manyetik ayırma protokolü (Şekil 1) göstermektedir. CD 11 b manyetik ayırma kiti fiyatı aynı olduğu için bu iyileştirilmiş yöntem orijinal kolonsuz metodu kadar hala mümkün. tamamlanma süresi, hücre hayatta kalması ve verimi maksimize etmek önemli olabilir yarısında, azaltılır. Özellikle, bu optimize yöntemden elde saflık ~>% 99, laboratuvarımızda ¹⁵ tarafından geliştirilen özgün kolonsuz yönteminden elde saflık üzerinde belirgin bir düzelme sağlanır. En önemlisi, CD11-PEIşıktan uzak kuluçkaya ihtiyacını ortadan kaldırarak ve floresan mikroskobu için kırmızı kanalının kullanımına izin veren, kullanılmaz. Son olarak, orijinal CD11b yönteminde olduğu gibi, yüksek verim ve saflıkta bir astrositik fraksiyonu, bu geliştirilmiş bir yöntem ile elde edilir. Astrositler onların homeostatik fonksiyonları patofizyolojisi ¹⁸ göre vazgeçilmezdir fikrine yol açan, CNS içinde en çok glial hücrelerdir. Bu glial hücreler, glial kendi soruşturma potansiyel örneklendiren, besin desteği sağlayan, kan-beyin bariyeri oluşturan nörotransmiter homeostazın korunması hasarı, nöro-yanıt glial yara izi oluşturma, öğrenme ve hafıza, ve Nöro gibi çeşitli fizyolojik fonksiyonlarında önemli bir rol oynar biyoloji ^19. Morfoloji ve mikroglia ve astrositlerin işlevselliği konfokal mikroskopi, Western kurutma nicel Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (QRT PCR), G aracılığıyla tespit edilmiştirRiess nitrit deneyi, ve Luminex multipleks sitokin deneyi. Bu protokolü tarafından sağlanan arıtma in vitro deneyler için önemli olan, tüm bunların mıkroglıal veya astrositik saflık, kırmızı kanalın kullanılabilirliği ile floresan mikroskobu geniş uygulamasına ilişkin güveni arttı ve zaman tasarrufu sunmaktadır.