Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit

Mikroglia sind Myb unabhängige Makrophagen mesodermalen Ursprungs, die von c-kit + / CD45- unterscheiden erythromyeloid Vorläufern in den Blutinseln des Dottersacks ^{1, 2.} Sobald embryologischen Mikroglia das zentrale Nervensystem (ZNS) kolonisiert haben, Übergangs- sie von einer zu einer verästelten amoeboid Form ^3. Diese Erwachsenen Mikroglia als surveillant klassifiziert , da ihre dynamische Verzweigungen das gesunde Hirnparenchyms für mögliche Beleidigungen Sonde ^4. Obwohl nur Mikroglia auf etwa 10% der Bevölkerung CNS Zelle beitragen, ihre Fähigkeit , untereinander zu tile gewährleistet maximaler Abtastung des Parenchyms ^{4, 5.} Gefahren-associated molecular patterns (DAMPS), wie beispielsweise α-Synuclein ^{6, 7} und Amyloid-β ⁸ oder pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) , wie beispielsweise Lipopolysaccharid (LPS) ^9, aktiviert klassisch Mikroglia eine entzündliche Reaktion durch Reversion zum amoeboid aktiven Zustand und die Produktion von Stickstoffmonoxid, Tumornekrosefaktor-α (TNF & agr;), Interleukin 1β gekennzeichnet Förderung (IL-1β), IL-6, IL-12 und das Chemokin CC motif Ligand 2 ^{9, 10, 11.} In neuroinflammatorischen Erkrankungen wie Parkinson-Krankheit, in denen pathogene α-Synuclein angesammelt hat, ist eine neurodegenerative Zyklus von dem Tod von dopaminergen Neuronen geschaffen, die mehr aggregierte α-Synuclein lösen, weitere klassische Aktivierung der Mikroglia ⁷ zu fördern. Ähnlich wie bei peripheren Makrophagen, Mikroglia kann auch die Fähigkeit hat, alternativ in der Gegenwart des anti-inflammatorischen Zytokine IL-4 und IL-10 aktiviert, so dass ihnen die potenten gebenial neuronaler Reparatur zu fördern und zu dämpfen Entzündungen ^{2, 11.} Abgesehen von ihren immunologischen Funktionen im ZNS, Mikroglia wurden als vital Regulator der neuronalen Schaltkreise beschrieben von Synapsen während der Entwicklung Beschneiden. Zum Beispiel haben Cx3cr1- KO – Mäuse weniger dichte Mikroglia und reduziert synaptic pruning, was zu einer Überfülle von dendritischen Dornen führt, unreife Synapsen, und die elektrophysiologischen Muster eines unterentwickelten CNS ^12. diese physiologische Komplexität und die vielfältigen funktionalen Rollen des Mikroglia in der Homöostase des ZNS zu verstehen, ist für Therapeutika Targeting neurodegenerativen Erkrankungen zur Suche kritisch.

Im Bereich der Neuroimmunologie, sind in – vitro – Experimente sehr wünschenswert , wegen der größeren Machbarkeit für mechanistische Studien, die geringer Wartungskosten, und für weniger zeit- und arbeitsintensiv. FurthermoRe, ist die Fähigkeit, Zellpopulationen zu isolieren, kritisch, um die Funktionalität dieser Zielzellen unter vorgeschriebenen Bedingungen zu beschreiben. Zahlreiche Mikroglia – Isolierungsmethoden existieren, aber sie sind durch ihre Fähigkeit begrenzt relativ hohe Zahlen und Reinheit für breites Experimentieren ^{13, 14, 15} zu erhalten. Zum Beispiel ist ein Cluster der Differenzierung 11b (CD11b) ein gemeinsamer Oberflächenmarker von Monozyten, Makrophagen und Mikroglia ^16. Durch Ausnutzen CD11b wurde ein Verfahren zur magnetischen Trennung zunächst als säulenbasierte Ansatz beschrieben , dass ~ 99,5% Reinheit ergab und ~ 1,6 × 10 ⁶ pro Mikrogliazellen neonatalen Gehirn ^17. Unser Labor vor kurzem entwickelte eine säulenfreien CD11b magnetischen Trennverfahren ^15, die wir mit Tagging CD11b mit einem monoklonalen Antikörper in einem Polystyrol – Röhrchen durchgeführt , konjugiert an Phycoerythrin (PE). Ein bispezifischer secondary Antikörper an PE und Dextran-Komplexe mit dem PE. Einmal gebunden, Dextran-beschichtete magnetische Partikel eingebracht, die an das Dextran Ende des Antikörper-Komplex binden. Schließlich wird die Polystyrol-Röhrchen in einem Magnet für Mikroglia-Isolierung angeordnet. Dieser Ansatz verdoppelte sich die Ausbeute auf ~ 3,2 x 10 ⁶ Mikroglia pro neonatalen Gehirn , sondern auf Kosten der Reinheit reduziert auf ~ 97%.

Hier zeigen wir , eine schnelles und verfeinertes säulenfreien CD11b magnetische Trennung Protokoll (Abbildung 1). Diese verbesserte Methode bleibt wie möglich als unsere ursprüngliche säulenfreie Methode, da der Preis des CD11b magnetische Trennung Satzes gleich ist. Die Ausführungszeit wird in die Hälfte reduziert, was zur Maximierung der Ausbeute und das Überleben der Zellen von entscheidender Bedeutung sein kann. Bemerkenswerterweise ist die Reinheit von diesen optimierten Verfahren erreicht ~> 99%, eine deutliche Verbesserung gegenüber der Reinheit von dem ursprünglichen säulenfreien Verfahren durch unser Labor ¹⁵ entwickelt erreicht. Am wichtigsten ist, CD11b-PEnicht verwendet wird, von der Licht entfällt die Notwendigkeit, und die Verwendung des roten Kanal für die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht inkubieren entfernt. Schließlich ist, wie in dem ursprünglichen CD11b-Verfahren, eine astrozytären Fraktion von hohen Ausbeute und Reinheit mit diesem verbesserten Verfahren erhalten. Astrozyten sind die zahlreichen Gliazellen im ZNS, die Idee führt , dass ihre homöostatischen Funktionen ¹⁸ in Bezug auf Pathophysiologie unverzichtbar sind. Diese gliale Zellen spielen eine Rolle bei verschiedenen physiologischen Funktionen wie die Blut-Hirn-Schranke bilden, nährstoff Unterstützung, Neurotransmitter Aufrechterhaltung der Homöostase, bilden glial Narben in Reaktion auf eine Verletzung, Neuroprotektion, Lernen und Gedächtnis, und Neuroinflammation, beispielhaft ihre investigatory Potential in glial Biologie ^19. Morphologie und Funktionalität von Mikroglia und Astrozyten wurden durch konfokale Mikroskopie, Western-Blot, quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR), G ermitteltRiess Nitrit-Test und der Multiplex-Zytokin-Assay Luminex. Die Verfeinerung dieses Protokoll zur Verfügung gestellt bietet mehr Vertrauen zu Mikroglia oder Astrozyten Reinheit, eine breitere Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie mit der Verfügbarkeit des roten Kanals betreffen, und spart Zeit, die alle für die in – vitro – Experimente wichtig sind.