בידוד ראפיד ומעודן CD11b מגנטי של Microglia הראשי עם טוהר משופר רבגוני

Microglia הם מקרופאגים תושב Myb עצמאית ממוצא mesodermal, אשר להבדיל מן c-kit + / CD45- erythromyeloid אבות באיים הדם של שק חלמון ^{1, 2.} לאחר microglia העוברית יש יישבה את מערכת העצבים המרכזית (CNS), כשהם עוברים מן אמבואידית לצורה מסועפת ^3. Microglia הבוגר אלו מסווגים surveillant מאז ההשלכות הדינמיות שלהם לחקור את מוח parenchyma הבריא ⁴ עלבונות פוטנציאל. למרות microglia רק לתרום כ 10% מכלל אוכלוסיית תא CNS, יכל אריח בין זה לזה מבטיח סריקה מרבית של parenchyma ^{4, 5.} Danger הקשורים דפוסים מולקולריים (damps), כגון α-synuclein ^{6, 7} ו עמילואיד-β ^8, או pathogen הקשורים דפוסים מולקולריים (PAMPs) כגון lipopolysaccharide (LPS) ^9, קלסיים להפעיל microglia לקדם תגובה דלקתית המאופיינת חזרה למצב הפעיל אמבואידית ואת הייצור של תחמוצת חנקנית, נימק גידול-α גורם (TNFα), 1β interleukin (IL-1β), IL-6, IL-12, והמוטיב CC chemokine ליגנד 2 ^{9, 10, 11.} בתנאי neuroinflammatory כגון מחלת פרקינסון, שבו-synuclein α פתוגניים צבר, מחזור ניווניות נוצר מן המוות של נוירונים דופאמינרגיים, אשר ישחררו-synuclein α מצטבר יותר, עוד יותר בקידום הפעלה קלסית של המיקרוגליה ^7. בדומה מקרופאגים היקפי, microglia אולי גם יש את היכולת לחילופין להפעיל בנוכחות של ציטוקינים אנטי דלקתי IL-4 ו- IL-10, לתת להם את החזקיםial לקדם תיקון עצבי הפחתת דלקת ^{2, 11.} מלבד התפקידים אימונולוגיים שלהם במערכת העצבים המרכזית, microglia תואר רגולטורים חיוניים של מעגלים עצביים על ידי גיזום סינפסות במהלך פיתוח. לדוגמה, עכברים KO Cx3cr1- יש פחות microglia צפופה וגיזום הסינפטי מופחת, אשר מוביל עודף של הקוצים הדנדריטים, סינפסות בשלה, ואת דפוסי אלקטרו של CNS מפותח ^12. הבנת מורכבות הפיזיולוגיות אלה התפקידים התפקודיים המגוונים של המיקרוגליה של הומאוסטזיס של CNS היא קריטית בחיפוש אחר תרופות מיקוד הפרעות ניווניות.

בתחום neuroimmunology, ניסויים במבחנה ב הם רצויים מאוד בגלל הכדאיות יותר עבור מחקרים מכניסטית, עלויות התחזוקה הנמוכות, וכן בשל היותו פחות הזמן- ועבודה אינטנסיבית. Furthermoמחדש, היכולת לבודד אוכלוסיות תאים הוא קריטי כדי להתוות את הפונקציונליות של אלה תאי היעד בתנאים שנקבעו. רבי שיטות בידוד microglial קיימות, אבל הם מוגבלים על ידי היכולת שלהם להשיג מספרים גבוהים יחסית וטוהר לניסויים רחבים ^{13, 14, 15.} לדוגמה, מקבץ של 11b בידול (CD11b) הוא סמן משטח משותף של מונוציטים, מקרופאגים, ו microglia ^16. על ידי ניצול CD11b, שיטה של הפרדה מגנטי תוארה לראשונה כגישה מבוססי עמודה שהניבה ~ 99.5% טוהר ~ 1.6 x 10 ⁶ microglia לכל המוח בילוד ^17. במעבדה שלנו לאחרונה פיתחה שיטה הפרדה מגנטי CD11b ללא עמודה ^15, אשר ביצענו ב צינור פוליסטירן ידי תיוג CD11b עם נוגדנים חד שבטיים מצומדות Phycoerythrin (PE). Seconda bispecificנוגדנים ר"י כדי PE ו מתחמי dextran עם PE. לאחר כבול, חלקיקים מגנטיים מצופה dextran מוצגים, אשר נקלטים על ידי תום dextran של הרכב הנוגדן. לבסוף, צינור הקלקר ממוקם מגנט עבור בידוד microglial. גישה זו הכפילה את התשואה ל ~ 3.2 x 10 ⁶ microglia לכל המוח בילוד אך במחיר של צמצום טוהר אל ~ 97%.

בזאת, אנו מדגימים פרוטוקול הפרדה מגנטי מהיר ומעודן טור נטול CD11b (איור 1). שיטה משופרת נשארת כפי ריאלית כשיטת הטור ללא המקורי שלנו מאז המחיר של ערכת ההפרדה מגנטית CD11b זהה. שעת ההשלמה מצטמצמת בחצי, מה שיכול להיות מכריע כדי למקסם הישרדות תא תשואה. יש לציין, כי הטוהר שהושג שיטת אופטימיזציה זה ~> 99%, שיפור ניכר לעומת טוהר מושגת משיטת הטור-חינם המקורית שפותחה על ידי המעבדה שלנו ^15. והכי חשוב, CD11b-PEלא מנוצל, ומבטל את הצורך לדגור הרחק אור ומאפשר את השימוש במסלול האדום עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לבסוף, כמו בשיטת CD11b המקורית, שבר astrocytic של תשואה וטוהרת גבוהות מתקבל עם שיטה משופרת. האסטרוציטים הם תאי גליה הרבים ביותר במערכת העצבים המרכזית, שמובילים את הרעיון כי הפונקציות ההומיאוסטטית שלהם הן הכרחיות ביחס פתופיזיולוגיה ^18. תאי גליה אלה ממלאים תפקיד פונקציות פיסיולוגיות מגוונות כגון להרכיב את מחסום דם-המוח, מתן תמיכה מזינה, שמירת הומאוסטזיס הנוירוטרנסמיטר, ויוצר צלקות גליה בתגובה לפציעה, neuroprotection, למידה וזיכרון, וכן neuroinflammation, הממחיש את פוטנציאל החקירה שלהם גליה ביולוגיה ^19. מורפולוגיה ופונקציונליות של המיקרוגליה האסטרוציטים כבר הוברר באמצעות מיקרוסקופיה confocal, סופג המערבי, תגובת שרשרת Real-Time פולימראז כמותיים (qRT-PCR), Gassay ניטריט ריס, ואת assay ציטוקינים זמנית Luminex. החידוד שמספק פרוטוקול זה מציע מוגברת ביטחון נוגעים טוהר microglial או astrocytic, יישום רחב יותר של מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הזמינות של הערוץ האדום, חוסך זמן, שכולן חשוב ניסויים במבחנה.