Snelle en Geraffineerde CD11b magnetische Isolatie van Primary Microglia met verbeterde zuiverheid en veelzijdigheid

Microglia zijn Myb onafhankelijk macrofagen van mesodermale oorsprong, die onderscheiden van c-kit + / CD45- erythromyeloid progenitorcellen in het bloed eilandjes van de dooierzak ^{1, 2.} Zodra embryologische microglia het centrale zenuwstelsel (CNS) hebben gekoloniseerd, die overstappen van een amoeboid een vertakte vorm ^3. Deze volwassen microglia worden geclassificeerd als surveillant omdat hun dynamische vertakkingen sonde het gezond hersenweefsel voor potentiële beledigingen ^4. Hoewel microglia enkel bij tot ongeveer 10% van het CZS celpopulatie, gaf aan tegels onderling verzekert maximale aftasten van het parenchym ^{4, 5.} Risico-geassocieerde moleculaire patronen (gedempt), zoals α-synucleïne ^{6, 7} en amyloid-β ⁸ of pathogen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's) zoals lipopolysaccharide (LPS) ^9, klassiek activeren microglia een ontstekingsreactie gekenmerkt door terugkeer naar de amoeboid actieve toestand en de productie van stikstofoxide, tumornecrosefactor-α (TNFa), interleukine 1β bevorderen (IL-1β), IL-6, IL-12, en de chemokine CC motief ligand 2 ^{9, 10, 11.} In neuro aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, waarbij pathogene α-synucleïne heeft verzameld, wordt een neurodegeneratieve cyclus gecreëerd uit de dood van dopaminergische neuronen, die meer geaggregeerd α-synucleïne vrij, verdere bevordering klassieke activering van microglia ^7. Soortgelijke perifere macrofagen, microglia kunnen ook de mogelijkheid om afwisselend te activeren in aanwezigheid van de anti-inflammatoire cytokines IL-4 en IL-10, waardoor ze de krachtigeial van het bevorderen van neurale reparatie en verzachtende ontsteking ^{2, 11.} Naast hun immunologische rol in het CZS, zijn microglia beschreven als essentieel regulatoren van neuronale circuits door snoeien synapsen tijdens de ontwikkeling. Bijvoorbeeld Cx3cr1- KO muizen hebben minder dicht microglia en verminderde pruning, wat leidt tot een overvloed aan dendritische onvolgroeide synapsen en elektrofysiologische patronen een onderontwikkelde CNS ^12. Inzicht in deze complexe fysiologische en diverse functionele rol van microglia in de homeostase van het CZS is cruciaal voor het onderzoek naar therapeutica gericht neurodegeneratieve aandoeningen.

Op het gebied van Neuroimmunology, in vitro experimenten zijn zeer gewenst vanwege de grotere haalbaarheid van mechanistische studies, lagere onderhoudskosten en minder tijds- en arbeidsintensief. Furthermoopnieuw, het vermogen om celpopulaties te isoleren is van cruciaal belang om de functionaliteit van deze doelcellen af ​​te bakenen onder de voorgeschreven omstandigheden. Tal van microglia isolatie methoden bestaan, maar ze zijn beperkt door hun vermogen om relatief grote aantallen en zuiverheid te verkrijgen voor breed georiënteerde experimenten ^{13, 14, 15.} Bijvoorbeeld, een cluster van differentiatie 11b (CD11b) is een gemeenschappelijk oppervlak marker monocyten, macrofagen en microglia ^16. Door gebruik CD11b werd een werkwijze voor magnetische scheiding eerst beschreven als een kolom benadering die leverde ~ 99,5% zuiverheid ~ 1,6 x 10 ⁶ microglia per hersenschade ^17. Ons laboratorium onlangs een kolomvrije CD11b magnetische scheidingswerkwijze ^15, die we in een polystyreen buis uitgevoerd door tagging CD11b met een monoklonaal antilichaam geconjugeerd aan fycoerythrine (PE). Een bispecifiek secondary antilichaam voor PE en dextran complexen met PE. Eenmaal gebonden worden met dextran beklede magnetische deeltjes geïntroduceerd, die binden aan het dextran einde van de antilichaamcomplex. Ten slotte wordt de polystyreen buis in een magneet voor microgliale isolatie. Deze benadering verdubbelde de opbrengst ~ 3,2 x 10 ⁶ microglia per neonatale hersenen, maar ten koste van het verminderen zuiverheid ~ 97%.

Hierin tonen we een snelle en geraffineerde kolomvrije CD11b magnetische scheidingsprotocol (figuur 1). Deze verbeterde werkwijze blijft uitvoerbaar als onze oorspronkelijke kolomvrije methode, omdat de prijs van het CD11b magnetische scheidingskit hetzelfde. De doorlooptijd is gehalveerd, die cruciaal zijn voor het maximaliseren van celoverleving en opbrengst kan worden. Met name de bereikte zuiverheid van deze geoptimaliseerde methode ~> 99%, een duidelijke verbetering ten opzichte van de bereikte zuiverheid van de oorspronkelijke kolomvrije ontwikkeld door ons laboratorium ^15. Belangrijker nog, CD 11-PEwordt niet gebruikt, waardoor de noodzaak om weg te incuberen tegen licht en die het gebruik van het rode kanaal voor fluorescentiemicroscopie. Tenslotte, zoals in het oorspronkelijke CD11b werkwijze kan een fractie van astrocytische hoge opbrengst en zuiverheid wordt verkregen met deze verbeterde werkwijze. Astrocyten de meest talrijke gliacellen in het centrale zenuwstelsel, wat leidt tot het idee dat hun homeostatic functies zijn onmisbaar in relatie tot de pathofysiologie ^18. Deze gliale cellen spelen een rol bij verschillende fysiologische functies zoals het vormen van de bloed-hersenbarrière, die voedingsstoffen ondersteunen, handhaven neurotransmitter homeostase, vormen gliale litteken in reactie op verwonding, neurobescherming, leren en geheugen, en zenuwontsteking, als voorbeeld hun onderzoeks- potentieel gliale ¹⁹ biologie. Morfologie en functionaliteit van microglia en astrocyten zijn vastgesteld via confocale microscopie, Western blotting, kwantitatieve Real-time PCR (qRT-PCR), GRiess nitriet assay en de Luminex multiplex cytokine assay. De verfijning die door dit protocol biedt meer vertrouwen met betrekking tot de microglia of astrocytaire zuiverheid, ruimere toepassing van fluorescentiemicroscopie met de beschikbaarheid van het rode kanaal, en bespaart tijd, die van belang zijn voor in vitro experimenten.