Summary

Isolamento magnético rápido e refinado CD11b da Primária Microglia com pureza e versatilidade

Published: April 13, 2017
doi:

Summary

Aqui, nós apresentamos um protocolo para isolar microglia de crias de rato pós-natais (dia 1) para experimentação in vitro. Este método improvisada de isolamento gera tanto rendimento e pureza elevados, uma vantagem significativa em relação aos métodos alternativos que permite a ampla gama de experimentação para efeitos de elucidação da biologia da microglia.

Abstract

Microglia são os principais respondedores a insultos do sistema nervoso central; no entanto, muito permanece desconhecido sobre o seu papel na regulação da neuroinflamação. Microglia s culas da mesoderme que funcionam de forma semelhante aos macrófagos na topografia de stress inflamatório. O (M1-type) clássica e alternativa (do tipo M2) ativações de macrófagos também foram estendidos para microglia em um esforço para melhor compreender a interação subjacente estes fenótipos têm em condições neuroinflamat�ios como Parkinson, Alzheimer e doença de Huntington. Em experiências in vitro, utilizando a microglia primário oferece resultados rápidos e fiáveis, que podem ser estendidos para o ambiente in vivo. Embora esta seja uma clara vantagem sobre a experimentação in vivo, isolando microglia ao conseguir rendimentos adequados de pureza óptima tem sido um desafio. Os métodos mais comuns actualmente em uso quer sofrem de baixa recuperação, baixo grau de pureza, ou ambos. Aqui, nós demmonstrar um refinamento do CD11b método de separação magnética sem colunas que atinge uma célula de recuperação elevado e pureza melhorada em metade da quantidade de tempo. Propomos este método otimizado como um modelo altamente útil de isolamento microglial primário para fins de estudar neuroinflamação e neurodegeneração.

Introduction

Microglia são macrófagos residentes Myb-independentes de origem mesodérmica, que diferenciam a partir de c-kit + / CD45- erythromyeloid progenitores nas ilhas de sangue do saco vitelino 1, 2. Uma vez que a microglia embriológicos colonizaram o sistema nervoso central (SNC), que a transição de uma para uma forma amebóide ramificado 3. Estes microglia adultos são classificados como surveillant desde suas ramificações dinâmicas sondar o parênquima cerebral saudável para potenciais insultos 4. Embora microglia só contribuem para aproximadamente 10% da população de células do SNC, a sua capacidade de telha entre si assegura varrimento máxima do parênquima 4, 5. Padrões perigo-associados moleculares (amortece), tais como α-sinucleína 6, 7 e 8-amilóide β, ou ppadrões moleculares athogen-associados (PAMP), tais como lipopolissacáridos (LPS) 9, classicamente activar microglia para promover uma resposta inflamatória, caracterizada pela reversão para o estado activo amebóide e a produção de óxido nítrico, factor de necrose tumoral-α (TNF?), 1β interleucina ligando (IL-1β), IL-6, IL-12, e o motivo de quimiocina CC 2 9, 10, 11. Em condições neuro-inflamatórias, tais como a doença de Parkinson, em que patogénico α-sinucleína acumulou, um ciclo neurodegenerativa é criada a partir da morte de neurónios dopaminérgicos, que libertam mais agregado α-sinucleína, promovendo ainda mais a activação de microglia clássica 7. Semelhante aos macrófagos periféricos, microglia pode também ter a capacidade para activar, alternativamente, na presença das citocinas anti-inflamatórias de IL-4 e IL-10, dando-lhes a potenteial de promover a reparação neural e atenuar a inflamação 2, 11. Para além das suas funções imunológicas no SNC, microglia foram descritos como reguladores vitais do circuito neuronal pela poda sinapses durante o desenvolvimento. Por exemplo, os ratinhos KO Cx3cr1- têm microglia menos densas e reduzida poda sináptica, o que leva a um excesso de espinhas dendriticas, sinapses imaturas, e os padrões electrofisiológicas de um CNS subdesenvolvida 12. Compreender estas complexidades fisiológicas e os diversos papéis funcionais da microglia na homeostase do SNC é crítica para a procura de agentes terapêuticos alvo desordens neurodegenerativas.

Na área de neuroimmunology, em experiências in vitro são altamente desejável por causa da maior viabilidade para estudos mecanicistas, os mais baixos custos de manutenção, e por ser menos tempo e trabalho intensivo. Furthermore, a capacidade para isolar populações de células é crítica para delinear a funcionalidade dessas células alvo sob condições prescritas. Existem numerosos métodos de isolamento microgliais, mas são limitadas pela sua capacidade para obter números relativamente elevados e pureza para a experimentação 13, 14, 15. Por exemplo, um aglomerado de diferenciação 11b (CD11b) é um marcador de superfície comum de monócitos, macrófagos, e microglia 16. Através da exploração de CD11b, um método de separação magnética foi descrito pela primeira vez como uma abordagem baseada em coluna que produziu ~ 99,5% de pureza e ~ 1,6 x 10 6 por microglia cerebral neonatal 17. O nosso laboratório desenvolvido recentemente um método de separação magnética CD11b livre de coluna 15, o que foi realizado num tubo de poliestireno por marcação CD11b com um anticorpo monoclonal conjugado com ficoeritrina (PE). A seconda biespec�icaanticorpo ry a PE e complexos de dextrano com o PE. Uma vez ligado, partículas magnéticas revestidas com dextrano são introduzidos, os quais se ligam ao fim de dextrano do complexo anticorpo. Por fim, o tubo de poliestireno é colocado em um íman para o isolamento da microglia. Esta abordagem duplicou o rendimento de ~ 3,2 x 10 6 por microglia do cérebro neonatal, mas à custa de reduzir a pureza de ~ 97%.

Aqui, demonstramos uma coluna isenta de CD11b protocolo de separação magnética rápida e refinado (Figura 1). Este método melhorado permanece como viável como o nosso método isento de coluna original já que o preço do kit de separação magnética CD11b é o mesmo. O tempo de conclusão é reduzido para metade, o que pode ser crucial para maximizar a sobrevivência das células e o rendimento. Notavelmente, a pureza conseguida por este método é optimizado ~> 99%, uma melhoria significativa sobre a pureza obtida a partir do método isento de coluna original desenvolvido pelo nosso laboratório 15. Mais importante ainda, CD11b-PEnão é utilizado, eliminando a necessidade de incubar ao abrigo da luz e permitindo o uso do canal de vermelho para a microscopia de fluorescência. Por último, tal como no método CD11b original, uma fracção astrocítica de elevado rendimento e pureza é obtida com este método melhorado. Os astrócitos são as mais numerosas células gliais no sistema nervoso central, levando à idéia de que as suas funções homeostáticas são indispensáveis em relação à fisiopatologia 18. Estas células gliais desempenhar um papel em diversas funções fisiológicas, tais como a formação da barreira sangue-cérebro, proporcionando suporte de nutrientes, mantendo neurotransmissor homeostase, formando cicatrizes gliais em resposta a uma lesão, a neuroproteco, a aprendizagem e a memória, e neuroinflamao, exemplificando o seu potencial de investigação no glial biologia 19. Morfologia e funcionalidade da microglia e astrócitos foram verificados através de microscopia confocal, transfercia de Western, quantitativo em tempo real de Reacção em Cadeia da Polimerase (qRT-PCR), Lensaio de nitritos Riess, e o ensaio multiplex citocina Luminex. O refinamento fornecida por este protocolo oferece maior confiança relativos à pureza da microglia ou astrócitos, a aplicação mais ampla da microscopia de fluorescência com a disponibilidade do canal de vermelho, e economiza tempo, todos os quais são importantes para experimentação in vitro.

Protocol

O uso dos animais e procedimentos protocolares foram aprovados e supervisionados pela Comissão Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC) da Universidade Estadual de Iowa (Ames, IA, EUA) 1. Crescimento de culturas gliais mistas Decapitar 1- filhotes de 2 dias de idade rapidamente com uma tesoura que operam 5,5 polegadas, e colocar as cabeças imediatamente em um tubo de 50 ml em gelo. Note que esta decapitação é o modo de eutanásia. Num capuz de fluxo de ar …

Representative Results

Microglia isolado utilizando o kit de CD11b selecção positiva II têm alta pureza microglia primários de ratinho foram isolados utilizando o protocolo acima mencionado e plaqueadas em lamelas de poli-D-lisina-revestidas para verificar a pureza de isolamento. Dez mil células foram plaqueadas por cavidade e análise imunocitoquimica foi efectuada utilizando molécula de adaptador se liga a cálcio ionizado 1 (Iba1) como um marc…

Discussion

Mais antigos métodos de isolamento microgliais têm recuperações limitados que não são apropriados para diversas análises de proteína por transferência de Western e análise de RNA por qRT-PCR. A adesão diferencial e métodos tripsinização leves são duas abordagens comuns, com baixos rendimentos microgliais 13, 14, 15. A abordagem baseada em CD11b coluna também tem baixa recuperação, mas consegue uma maior pureza…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) Subvenções: NS088206 e ES026892. O W. Eugene e Linda Lloyd cadeira dotada para AGK e Deans Professorship para AK também são reconhecidas.

Materials

EasySep CD11b Separation Kit II StemCell Technologies 18970
EasySep Magnet StemCell Technologies 18000
DMEM/F12 (1:1) (1x) Life Technologies  11330057
Sodium Pyruvate Life Technologies  11360070
MEM Non-essential amino acids (100x) Life Technologies  11140050
L-Glutamine (100x) Life Technologies  25030081
EDTA Fisher Scientific AM9260G
Fetal Bovine Serum Sigma 13H469
0.25% Trypsin-EDTA Gibco by Life Technologies 25200
Dulbecco's PBS Gibco by Life Technologies 14190250

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Cite This Article
Sarkar, S., Malovic, E., Plante, B., Zenitsky, G., Jin, H., Anantharam, V., Kanthasamy, A., Kanthasamy, A. G. Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility. J. Vis. Exp. (122), e55364, doi:10.3791/55364 (2017).

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