Rapid e raffinato CD11b isolamento magnetico di primaria microglia con purezza migliorata e versatilità

Microglia sono macrofagi residenti Myb indipendenti di origine mesodermica che differenziano da c-kit + / CD45- progenitori nelle isole sanguigni del sacco vitellino ^{1, 2} erythromyeloid. Una volta microglia embriologici hanno colonizzato il sistema nervoso centrale (CNS), la fase di transizione da un ameboide ad una forma ramificata ^3. Questi microglia adulti sono classificati come surveillant dal loro ramificazioni dinamiche sondare il parenchima cerebrale sano per i potenziali insulti ^4. Sebbene microglia contribuiscono solo a circa il 10% della popolazione cellulare CNS, la loro capacità di piastrelle tra di loro assicura scansione massima del parenchima ^{4, 5.} Modelli pericolo associati molecolari (smorza), come α-sinucleina ^{6, 7} e ⁸ β-amiloide, o ppattern molecolari athogen-associati (PAMPs) come lipopolisaccaride (LPS) ^9, attivano classicamente microglia per promuovere una risposta infiammatoria caratterizzata da reversione allo stato attivo amoeboid e la produzione di ossido nitrico, fattore di necrosi tumorale-α (TNF), interleuchina 1β (iL-1β), iL-6, iL-12, e il motivo CC chemochina ligando 2 ^{9, 10, 11.} In condizioni neuroinfiammatorie come il morbo di Parkinson, in cui patogeni α-sinucleina ha accumulato, un ciclo neurodegenerativa è creato dalla morte dei neuroni dopaminergici, che rilasciano più aggregate α-sinucleina, promuovendo un'ulteriore attivazione classica della microglia ^7. Simile a macrofagi periferici, microglia può anche avere la capacità di attivare alternativamente in presenza di citochine antinfiammatorie IL-4 e IL-10, dando loro la potenteial di promuovere la riparazione neurale e attenuando l'infiammazione ^{2, 11.} A parte i loro ruoli immunologici nel SNC, microglia sono stati descritti come regolatori vitali della circuiteria neuronale potatura sinapsi durante lo sviluppo. Ad esempio, i topi hanno Cx3cr1- KO microglia meno dense e ridotta potatura sinaptica, che porta ad una sovrabbondanza di spine dendritiche immature, sinapsi, ei modelli elettrofisiologici di un sottosviluppato CNS ^12. La comprensione di queste complessità fisiologici ei diversi ruoli funzionali della microglia nell'omeostasi del sistema nervoso centrale è fondamentale per la ricerca di terapie rivolte malattie neurodegenerative.

Nel settore della neuroimmunologia, esperimenti in vitro sono altamente desiderabile a causa della maggiore fattibilità per studi meccanicistici, i minori costi di manutenzione, e per essere meno tempo e laborioso. Furthermori, la possibilità di isolare popolazioni di cellule è fondamentale per delineare la funzionalità di tali cellule bersaglio nelle condizioni prescritte. Numerosi metodi di isolamento microgliali esistono, ma sono limitati dalla loro capacità di ottenere numeri relativamente elevati e purezza per un'ampia sperimentazione ^{13, 14, 15.} Ad esempio, un cluster di differenziazione 11b (CD11b) è un marcatore di superficie comune dei monociti, macrofagi e microglia ^16. Sfruttando CD11b, un metodo di separazione magnetica è stata descritta come un approccio basato su colonne che ha dato ~ 99,5% di purezza e ~ 1,6 x 10 ⁶ microglia per neonatale cervello ^17. Il nostro laboratorio ha recentemente sviluppato un CD11b metodo di separazione magnetica senza colonne ^15, che abbiamo eseguito in un tubo di polistirene mediante codifica CD11b con un anticorpo monoclonale coniugato con ficoeritrina (PE). Una Seconda bispecificoanticorpo ry a PE e complessi destrano con il PE. Una volta legato, particelle magnetiche destrano rivestite vengono introdotti, che si legano alla fine destrano del complesso anticorpo. Infine, il tubo polistirolo viene collocato in un magnete per l'isolamento della microglia. Questo approccio raddoppiato il rendimento a ~ 3,2 x 10 ⁶ microglia al cervello neonatale, ma a costo di ridurre purezza a ~ 97%.

Qui, dimostriamo una rapida e raffinato privo di colonna CD11b magnetico protocollo di differenziazione (Figura 1). Questo metodo perfezionato rimane fattibile come nostro metodo libero-colonna originale poiché il prezzo del kit separazione magnetica CD11b è lo stesso. Il tempo di completamento è ridotta a metà, che può essere cruciale per massimizzare la sopravvivenza delle cellule e la resa. In particolare, la purezza ottenuto da questo metodo ottimizzato è ~> 99%, un netto miglioramento rispetto alla purezza raggiunto dal metodo originale senza colonne sviluppato dal nostro laboratorio ^15. Ancora più importante, CD11b-PEnon è utilizzata, eliminando la necessità di incubare lontano dalla luce e permettendo l'utilizzo del canale rosso per microscopia a fluorescenza. Infine, come nel metodo originale CD11b, una frazione astrocitaria di elevata resa e purezza è ottenuto con questo procedimento perfezionato. Gli astrociti sono più numerose cellule gliali nel sistema nervoso centrale, che porta l'idea che le loro funzioni omeostatiche sono indispensabili in relazione alla fisiopatologia ^18. Queste cellule gliali svolgono un ruolo in diverse funzioni fisiologiche quali formano la barriera emato-encefalica, che fornisce il supporto di nutrienti, mantenendo neurotrasmettitore omeostasi, la formazione di cicatrici gliali in risposta al danno, neuroprotezione, l'apprendimento e la memoria, e neuroinfiammazione, esemplificando il loro potenziale di indagine in gliale biologia ^19. Morfologia e la funzionalità della microglia e astrociti sono state accertate tramite microscopia confocale, Western blotting, quantitativa Real-Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR), Gtest nitriti Riess, e il test multiplex citochina Luminex. La raffinatezza fornita da questo protocollo offre una maggiore fiducia di pertinenza di purezza microglia o astrociti, più ampia applicazione della microscopia a fluorescenza con la disponibilità del canale rosso, e fa risparmiare tempo, che sono tutti importanti per la sperimentazione in vitro.