פרוטוקול תרבית תאי ראפיד פוסט מורטם של Glioma Pontine המפוזר העצמותי (DIPG)
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לעיבוד המהיר של דגימות גליומה pontine מהותיות מפוזרות שלאחר מוות להקמת מודלי תרבית תאים שמקורם בחולה או אפיון ישיר של תאים סרטניים microenvironmental.
Abstract
מפוזר עצמותית Pontine Glioma (DIPG) הוא גידול בגזע המוח בילדות שנושאת פרוגנוזה קטלנית אוניברסלית. בגלל כריתה כירורגית אינה אסטרטגית טיפול קיימא הביופסיה אינה נעשית באופן שיגרתי, את הזמינות של דגימות חולות למחקר מוגבלת. כתוצאה מכך, מאמצים ללמוד את המחלה הזאת כבר לערער על ידי מיעוט של מודלי מחלה נאמנים. כדי לתת מענה לצורך זה, אנו מתארים כאן פרוטוקול לעיבוד המהיר של דגימות רקמת נתיחה שלאחר מוות על מנת ליצור מודלי תרבית תאי חולה נגזרת עמידים שיכול לשמש מבחני חוץ גופייה או in vivo ניסויי xenograft orthotopic. מודלים אלה יכולים לשמש מסך עבור מטרות תרופה פוטנציאל ללמוד תהליכי pathobiological מהותיים בתוך DIPG. פרוטוקול זה ניתן להאריך עוד יותר לנתח לבודד תאים סרטניים microenvironmental באמצעות Cell מופעל קרינת מיון (FACS), המאפשר ניתוח בדיעבד של אקס גןpression, ביטוי חלבון, או שינויים אפיגנטיים של הדנ"א בתא בתפזורת או ברמת תא בודד. לבסוף, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם כדי ליצור תרבויות נגזרות מטופלות עבור גידולים במערכת עצבים מרכזיים.
Introduction
DIPG הוא ממאירות במערכת עצבים מרכזיות אגרסיביות שעולות פונס הגחון, בדרך כלל במהלך אמצע ילדות 1, 2. למרות עשרות שנים של ניסויים קליניים, הטיפול הנוכחי מוגבל רדיותרפיה, המספקת שיפור זמני או ייצוב של סימפטומים ורק מרחיב הישרדות החציוני בשיעור ממוצע של 3 חודשים. אפילו עם הקרנות, חציון הישרדות כוללת היא רק 9 חודשים עם 90% מהילדים מתים מהמחלה בתוך 2 שנתי אבחנה ראשונית. בגלל אופי infiltrative של גידול ואת הפונקציות הקריטיות של גזע המוח, כריתה כירורגית אינה אפשרית. יתר על כן, בארצות הברית, קבלת ביופסיות כירורגיות עבור DIPG יש היסטוריה לא בוצע 3, כמו ניתוח histopathological אין תפקיד נוכחי המנחה טיפול ואבחון קליניים יכול בדרך כלל להתבצע על ידי הדמייה לבד. לפיכך, על זמינותו של f רקמת הגידולאו מחקר מוגבל, הגבלת מאמצים לערוך מחקר על מולקולות תרופה מועמדות לבין ביולוגית גידול הבסיסית. יש לציין, שיפורי טכניקות הדמייה ו stereotactic אפשרו לפיתוח ביופסיות בטוחות של DIPG בשנים האחרונות 4, אשר, בשילוב עם התקדמות בביולוגיה מולקולרית, שינו את הבנתנו של המחלה. נכון לעכשיו, ניסויים קליניים מרובים באמצעות ביופסית upfront ו פרופיל מולקולרי של DIPG עבור individualizing תוכניות טיפול נמשך (NCT01182350, NCT02274987) 5.
DIPG ו גליומות בדרגה גבוהה ילדים אחרות מייצגים מחלות נפרדות מעמיתיהם גליובלסטומה בוגרי 6, 7, ובכך הדגמים ניסיוניים נאמנים של DIPG נחוצים כדי להבין פתופיזיולוגיה ייחודי ולגלות אסטרטגיות טיפוליות יעילות. בשנים האחרונות, התמקד מאמצים להשיג גידול DIPG tנושא למחקר בעת הנתיחה או, פחות נפוץ, ביופסיה חוללה מהפכה בהבנתנו ויכולת ללמוד DIPG. הגנום כולו רצף המאמצים גילה מוטציה חוזר בענפי היסטון H3, 3A המשפחה (H3F3A) ו היסטון אשכול 1, H3b (HIST1H3B), המייצג את הדוגמה הראשונה של מחלות אנושיות נגרמת על ידי מוטציות היסטון קידוד חלבונים 8, 9, 10, 11 . יתר על כן, קבוצת משנה של DIPGs מבטא מוטציות בגן ACVR1, אשר לא דווחו בעבר בסרטן אך זהים מוטציות נמצא ossificans fibrodysplasia הפרעה התפתחותית מולדת הילדות progressiva 8, 9, 10, 11. כמו כן, בתרביות תאי DIPG חולת הנגזרות הראשונות מו xenograft orthotopicdels החברה הוקמו 1, 2, 12, 13, 14, וכן מודלים עכבר הוקמה באמצעות השתלה שלא מבן-מינו ישירה של תאים סרטניים לעכברים immunodeficient כדי ליצור xenografts סדרתי 3, 14, 15. מאמצי הקרנת סמים ראשוניים שהתקבלו בעזרת מודלים חולים נגזר אלו זיהו סוכני רומן מבטיחים לתרגום קליני 4, 14 ו הניחו את היסודות לפחות ניסוי קליני אחד (NCT02717455).
הצעדים הראשונים אלה אל הקדמה הם רק ההתחלה, דגימות רקמות מטופל נגזרות רבות ומודלי התרבות תהיינה צורך להגדיר תת סוגים של המחלה ולפתח את האסטרטגיות טיפוליות היעילות ביותר. מנוע גנטימודלי עכבר ered של DIPG יהיו גם להקל מחקרים שמטרתם לקדם את ההבנה הבסיסית שלנו של המחלה. מאמצים שנעשו כדי ליצור מודלים גנטיים DIPG יסתייעו המחקרים גנומי היסוד שנדונו לעיל, אך כיום מספר מצומצם של אפשרויות זמינים. אחד כזה מודל, אשר מייצר גליומות בגזע המוח בדרגה גבוהה דומה היסטולוגית, משתמשת RCAS / tv-נגיפי מערכת לנהוג ביטוי יתר PDGF-B ואובדן Ink4a-ARF בתאים חיובית-nestin ב השקע האחורי של עכברים בילוד 5, 16. גישה נוספת כרוכה משחזרת מוטציות DIPG הקשורים מרכזיים (מוטציה K27M H3.3 היסטון, אובדן p53 ו PDGFRA ההפעלה) בתאים עצביים מבשר שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים, וזה מספיק כדי להבהיר תאים אלה 6 tumorigenic, 7, 17. השילוב של שיטות גנטיות וסבלני-derivמודלי ed ייאפשרו בניסויים פרה-קליניים ולקדם את הפיתוח של טיפולים יעילים.
כדי לענות על האתגרים למחקר DIPG שפורט לעיל, פרוטוקול נתיחה מהיר זו פותח כדי ליצור תרביות תאים שמקורם בחולה לחקירה 8, 9, 10, 11, 12, 14. הפרוטוקול נועד להגן על הכדאיות של הרקמות למקסם את הסיכוי של יצירת תרבויות עמידות למרות האתגרים הקשורים במרווחים וזמן תחבורה מורחבים שלאחר מוות. כאשר נוצרו בהצלחה, תרבויות DIPG אלה יכולים לשמש מניפולציות הבאות במבחנה ובניסויי xenograft vivo, המאפשרות הערכה של מולקולות טיפוליות פוטנציאל על תאים שמקורם בחולה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה לעיבוד מהיר של תרומות רקמת הגידול שלאחר המוות לפתח בתרביות תאים שמקורם בחולה, אשר ניתן להשתמש בהם במגוון במבחנה או בניסויים vivo. בשל אופיו של עבודה עם דגימות הנתיחה, שמירה על כדאיות מדגם מציבה אתגר משמעותי. מספר גורמים תורמים, כולל מרווח שלאחר המוות לבצע נתיחה או את הזמן הנדרש להובלת רקמות, יש לצמצם ככל האפשר, אך לעתים קרובות קשה לשלוט. מניסיוננו, מרווח שלאחר מוות של פחות מ 6 – 8 שעות (מרגע מות הזמן כי רקמת ממוקם משלוח קרים כקרח ומדיה תחבורה) הניב את הסיכוי הטוב ביותר של הקמת תרבית תאים עמידה. עדיף אז לקבל את הרקמות לבדיקה במעבדה תוך 24 שעות, ו לעבד אותו לתרבות מיד עם קבלתן.
מאז המיקום של אלה מקרים נדירים משתנה מאוד, ואיכות הצעד יחזור רקמה מאוד משפיעה על סיכויי הצלחה, הלוגיסטיקה של ביצוע הנתיחה יכולה להיות מאתגרת. במקרים רבים, על מנת להשיג את מסגרת זמן 6-8 שעות, זה לא ריאלי לנהל את קציר הרקמות לעבר מרכז אקדמי. במקום זאת, שיש לשירות שחזור רקמות תורן לשחזר את רקמת הגידול בבית ההלוויות תחת פרוטוקול שאושר IRB הוא לעתים קרובות יותר ומועיל להתאוששות רקמות. קבלת הסכמה מדעת מראש מוות מומלצת ומקל על התכנון הלוגיסטי. הכנת ערכות נתיחה עצמאית עם הוראות ברורות ויסודיות ואספקה סטרילית לאחזור רקמות (כפפות, וילאות, אזמלים) מומלץ בחום. בנוסף, הקמת נקודות ברורות של תקשורת בין החוקר, פתולוג, ואת בית הלוויות היא קריטית. לדוגמה, החוקר צריך לדון פרוטוקול עם הפתולוג לפני הנתיחה ולהאיר שגיאות נפוצות. שגיאות אלה כוללים מיקרוביאל זיהום (בדרך כלל שמרים) במהלך אחזור רקמות, אי הספינה באמצעות משלוח לילה / מזורז וכישלון לשלוח את המדגם על הקרח רטוב מספיק במיכל thermoinsulated. לבסוף, אנו ממליצים להשתמש שירות שליחים מדלת לדלת למשלוח של המדגם כדי לצמצם את זמן ההובלה.
טיפול צריך גם לקחת במהלך דיסוציאציה רקמות לשמר כדאיות התא. למשל, השימוש במדים שנועד לשמר בריאות רקמה עצבית לתחבורה (Hibernate-A בתוספת אנטיביוטיקה / antimycotic) יגדיל את הסיכוי של יצירת תרבות מוצלחת. כמו כן, חשוב לשמור על המדגם בטמפרטורה קרה לאורך כל הפרוטוקול תמיד על ידי העברת דגימות קרח. איסוף שני שברי הניתוק מכאניים ו האנזימטית יחד עם מזעור טחינה דק יכול לשפר את הצלחת פרוטוקול, כמו שני השלבים הללו טראומתיים לתאים. מניסיוננו, בעוד תרבויות המצליחים ביותר לצמוח מתוך שני שברים, היו לנו מקרים שבם רק אחד משתי ההכנות הוקם תרבות עמידה, פוטנציאל המשקף את האופי העדין של דגימות אלה. עוד צעד טראומטי בפרוטוקול הוא טחינה דקה; אסטרטגיה אחת שיכול לצמצם את מידת הטחינה הדקה צורך היא להבטיח את הדגימות טחונות ביסודיות ממש בהתחלה של התכשיר. דוגמאות נוספות של היבטים של הפרוטוקול שנועד לשפר את הכדאיות המדגמת כוללות מאגרי הוספה (למשל, HEPES) ברחבי הפרוטוקול, אשר הוא קריטי במיוחד במהלך דיסוציאציה האנזימטית.
שינוי אפשרי של פרוטוקול זה להגדיל כדאיויות תא נוסף הוא הסר של הצעד ימס כדוריות הדם אדום ACK. עם זאת, במקרה זה, הוא לעתים קרובות אז יש צורך לבצע צעד תמוגה ACK במהלך השבוע הראשוני בתרבות להסיר תאי דם אדומים. היבט נוסף של פרוטוקול זה שעשוי להיות שונה הוא חיסול המיאלין ופסולת הסלולר באמצעות densit סוכרוזשיפוע y. באופן ספציפי, אסטרטגיות אחרות דווחו לשפר כדאיויות תא של תאי microglial גם אפשריות בשלב זה, כגון שיפוע צפיפות רציף Percoll 18 או חרוזי הסרת המיאלין מגנטיים.
לבסוף, המשך בין דיסוציאציה רקמות הראשונית והופעת neurospheres משתנה בין דגימות יכול לקחת בין שבוע לחודש או יותר. מאז התרבויות הראשוניות בדרך כלל מכילות מידה משמעותית של תאים מתים ופסולת הסלולר, זה יכול להיות מאתגר לקבוע אם תאי קיימא להישאר; התרבות צריכה להישמר במשך לפחות 4 – שבועות 8 (איור 2). אסטרטגיה אחת לבידוד תאי גדלים מן ההריסות שנותרו מוצגת כאן (כלומר להפוך סינון צבירי תאים מחדש ציפוי בתקשורת טריה). ההחלטה אם להמשיך לשמור על תרבות היא בסופו של דבר החלטה כל מקרה לגופו בהסתמך על גורמים סביב הדואר נתיחה (למשל, מרווח שלאחר מוות ממושך, בעיות במהלך הובלת רקמות), ניתוק הרקמות (למשל, דם מוגזם או פסולת), ואיך המדגם מופיע בתרבות. ברגע תרבות מוקמת, הזהות צריכה להיות מאומתת על ידי טביעת אצבע DNA באמצעות ניתוח חוזר טנדם קצר או שיטה דומה, השוואת התרבות למדגם של הגידול המקורי נשמר למטרה זו. אנו ממליצים אימות תרבויות באופן שיגרתי על ידי DNA טביעת אצבעות, כדי לוודא ששום זיהום על ידי תרבויות אחרות התרחש, למשל כל 3 – 6 חודשים.
הדור של תרבויות DIPG חולה הנגזרת הללו מייצג צעד חשוב בפיתוח המוצלח של טיפולים יעילים. הרחבת תרבויות DIPG נגזר המטופל הזמין ומודלי xenograft תהיה קריטית בזיהוי האסטרטגיות הטיפוליות היעילות ביותר, ובסופו של דבר להתגבר על המחלה הרסנית הזאת.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים בתודה להכיר תמיכה מקרן מק'קנה קלייר, המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NINDS K08NS070926 ו R01NS092597), משרד ההגנה (NF140075), קליפורניה מכון לרפואת הרגנרציה (CIRM RB4-06093 ו RN3-06510), הלימונדה של אלכס סטנד Foundation, The Cure מתחיל עכשיו קרן DIPG שיתופית, Lyla נסולי קרן, לפענח סרטן ילדים, קרן גידול ילדות המוח, מתיו לארסון קרן, קרן V, גודפרי קרן משפחת לזכרו של פיונה פנלופה, קרן DIPG Wayland וילאר, דילן Jewett , קונור ג'ונסון, זואי גאנש, דילן פריק, אביגיל ג'נסן, והקרנות הזיכרון ג'ניפר קרנץ, קרן N8, וירג'יניה ו DK לודוויג קרן לחקר הסרטן, המכון לחקר בריאות הילד בסטנפורד אן ט ורוברט מ בס הפקולטה נתרמו מלגות Pediatric מחלות סרטן הדם.
Materials
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco | 24020-117 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Liberase DH (Collagenase/Dispase) | Roche | 5401054001 | |
| DNAse I | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| Neurobasal-A | Gibco | 10888-022 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| GlutaMAX-I (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| B27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Human PDGF-AA | Shenandoah Biotechnology | 100-16 | |
| Human PDGF-BB | Shenandoah Biotechnology | 100-18 | |
| Human EGF | Shenandoah Biotechnology | 100-26 | |
| Human FGF | Shenandoah Biotechnology | 100-146 | |
| Sterile scalpel blades | Bard Paker | 372610 | |
| Curved hemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| 100 x 20 mm cell culture dish | Corning | 353003 | |
| Sterile forceps | TWD Tradewinds | DF8988-5 | |
| Sterile drapes | 3M | 2037 | |
| Sterile gloves | Kimberly Clark | 1182307 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| 100 micron mesh filter | Fisher | 352360 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 1495949A |
References
- Fisher, P. G., et al. A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities. Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).
- Johung, T. B., Monje, M. Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic. Curr. Neuropharmacol. , (2016).
- Cage, T. A., et al. Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children. Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas. Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Kieran, M. W. Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).
- Sturm, D., et al. Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge. Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).
- Jones, C., Baker, S. J. Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma. Nat. Rev. Cancer. , (2014).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).
- Wu, G., et al. The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma. Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).
- Fontebasso, A. M., et al. Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma. Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).
- Buczkowicz, P., et al. Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating. Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).
- Monje, M., et al. Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).
- Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).
- Grasso, C. S., et al. Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Med. , 1-10 (2015).
- Shu, Q., et al. Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma. Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).
- Becher, O. J., et al. Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma. Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).
- Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation. Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
