Ein Protokoll für schnelle Post-mortem-Zellkultur von Diffuse Intrinsic Ponsgliom (DIPG)

Dieses Protokoll wurde mit der Zustimmung aus dem Institutional Review Board mit entsprechenden de-Identifizierung aller Patientendaten und in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen der Menschen durchgeführt. Erhalten Sie alle geeigneten Institutional Review Board Genehmigung und informierte Zustimmung von der Familie des Patienten, bevor sie mit diesem Protokoll zu arbeiten. 1. Gewinnung Gewebeproben HINWEIS: Eine kritische Komponente dieses Protokoll erfordert die korrekte Handhabung des Spenden Gewebe sofort zum Zeitpunkt der Autopsie beginnen. Die gesamte Probe Lebensfähigkeit hängt maßgeblich von der Post-Mortem – Intervall (PMI) minimiert wird , sofort das Gewebe in das entsprechende kalte Medium mit Antibiotika / Antimykotika, halten die Probe auf nassem Eis während der Beförderung ergänzt Übertragung und Aufrechterhaltung einer sterilen Technik während des gesamten Protokolls. Nach einer entsprechenden Meldungeiner drohenden Spende, eine Probenentnahme-Kit vorbereiten. Mit einer Transportkiste mit einem isolierten Behälter, der direkt für den Rücktransport der Gewebeprobe verwendet werden kann, umfassen die folgenden Materialien: Fügen Sie Materialien für sterile Zubereitung, einschließlich sterile Handschuhe, Vorhänge und Skalpelle. Fügen Sie 8 – 10 sterile 50 ml konischen Röhrchen mit 30 ml Versand Medien in dem isolierten Behälter mit Eis oder Kältepackungen. HINWEIS: Während jede Standard-Zellkulturmedien arbeiten können, ist die beste Probe Lebensfähigkeit mit Hibernate-A mit Antibiotika / Antimykotika ergänzt erhalten wird. Fügen Sie alle weiteren Probenröhrchen für andere Analysen (zB Fixierer). Wenn der Autopsie wird nicht am Standort des Forschers durchgeführt werden, umfassen ein Dokument, das eindeutig fest, wie die Tumorprobe zu sammeln. Dazu gehören Details wie Aufrechterhaltung der Sterilität, Probenröhrchen auf nassem Eis zu halten, und auch Proben aus dem Mittelhirns und der Medulla als tumor Zellen eindringen oft diese Regionen. Pflegen Sie Sterilität bei der Autopsie. Betrachten Sie das Gehirn steril im Inneren des Schädels, so beobachten sterile Technik (einschließlich der Änderung Handschuhe), wenn der Schädel geöffnet ist. Vermeidung von Kontamination mit Haut und Haar ist von entscheidender Bedeutung. Präparieren Sie den Tumor von der Bauchseite (dem "Bauch" des Pons, siehe Zusatz Abbildung 1). Mit einem sterilen Skalpell, klein geschnitten 1 cm Stücke aus dem Tumor und übertragen sofort in kalte Versand Medien (siehe Hinweis in Schritt 1.1.2) und auf nassem Eis gelegt. Platz 10 ml Gewebe in jedes Röhrchen, was zu einem Endvolumen von Gewebe und Medium in jedem Röhrchen von 40 ml. Hinweis: Im Fall von DIPG infiltriert das Tumor diffus Pons und häufig der Rest des Hirnstamms. 4 Rohre (30 – – 40 ml Gewebe) von Pons und 1 bis 2 Schläuche (10 – 20 ml Gewebe) jeweils aus Mittelhirns und Medulla so viel von der Probe wie möglich, typischerweise einschließlich 3 als solche sammeln. Sammeln Sie samsätze aus dem Mittelhirns und der Medulla zur Brücke gegenübergestellt, die oft viele Tumorzellen enthalten. Nach der Probensammlung, versenden die Proben O / N auf nassem Eis in dem isolierten Behälter. Nicht auf Trockeneis versenden die Probe, wie das Einfrieren der Zellen zu töten. 2. Vorbereitung der Probenbearbeitung Vor der Probenvorbereitung beginnen, Gewebekulturhauben zusammen mit Rasierklingen, gebogen hemostats und alle anderen nicht-sterilen Werkzeugen unter UV-Licht für 1 h sterilisieren. Führen alle der folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen Kontamination der Kulturen zu verhindern. Vorbereiten und Sterilfilterlösungen. Zur Herstellung von 1,8 M Saccharose-Lösung, lösen sich 308,07 g Saccharose in 300 ml destilliertem Wasser. 50 ml 10x Hank's-gepufferter Saline Solution (HBSS) ohne Calcium oder Magnesium und bringen auf 500 ml Gesamtvolumen mit destilliertem Wasser. Lagerung bei 4 ° C. Um die enzymatische Verdauung Lösung vorzubereiten, nehmen 50 ml HBSS mit Calcium und Magnesium für jede 10 ml zerkleinerte Gewebe und füge 500 & mgr; l 5 mg / ml Desoxyribonuclease I (Endkonzentration 50 ug / ml), 500 ul 2,5 mg / ml Kollagenase I / II und Dispase – Lösung (Endkonzentration 25 & mgr; g / ml) und 500 ul 1 M HEPES-Puffer. Vorwärmen Aufschlusslösung in einem 37 ° C Wasserbad. Um Tumorstamm Medien (TSM) Basis vorbereiten, mischen 250 ml Neurobasal-A, 250 ml Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium: Nährsalzgemisch F12 (DMEM / F12), 5 ml 100x Antibiotikum-Antimykotikum, 5 ml 200 mM L-alanyl-L- Glutamindipeptid (GlutaMAX-A), 5 ml HEPES-Puffer, 5 ml 100 mM Natriumpyruvat und 5 ml 100x MEM nicht-essentielle Aminosäuren. Zur Vorbereitung komplette TSM mit Wachstumsfaktoren, die folgenden Ergänzungen TSM Base: 50x B27 Supplement Minus Vitamin A (1:50), humanen epidermalen Wachstumsfaktor (H-EGF, 20 ng / ml), menschliche Fibroblasten-Wachstumsfaktor (H- FGF 20 ng / ml), menschliches Platelet-derived Growth Factor AA (H-PDGF-AA, 10 ng / ml),menschliche Platelet-derived Growth Factor BB (H-PDGF-BB, 10 ng / ml) und Heparin-Lösung (2 & mgr; g / ml). Vorzukühlen einer Laborzentrifuge mit einem Schwenkbecherrotor auf 4 ° C ausgestattet. 3. Mechanische Distanzierung Übertragen Sie das Gewebe in eine Hoch walled 100 mm x 20 mm Zellkulturschale. Entfernen Sie das Medium Überbleibsel aus Versand und ersetzen mit 10 bis 15 ml kaltem Kulturmedien. die gekrümmten hemostats mit einer Rasierklinge zu erfassen, um das Gewebe fein hacken, während offensichtlich Blutgefäße oder Hirnhaut zu entfernen. HINWEIS: Die endgültige Gewebefragmente sollte kleiner als 1 mm sein (siehe 1B). Übertragen Sie das Gewebe in einen sauberen 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Zellkulturschale mit weiteren 5 ml kaltem Kulturmedien und Transfer zum konischen Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt nach Bedarf verbleibende Gewebe zu übertragen. Mit einem 10 ml serologische Pipette, verreiben sanft (4 – 5 mal). Lassen Sie größere tissue Fragmente zum Boden des Röhrchens absetzen. Falls erforderlich, Zentrifuge kurz auf die Probe für 1 min (350 × g, 4 ° C). Sammeln Sie die mechanisch dissoziiert Fraktion. Entfernen Sie den Überstand und filtern sie durch einen 100 & mgr; m-Filter in ein neues 50 ml konischen Röhrchen mit "Mechanische Distanzierung." Kehren Sie die Filter über dem ursprünglichen konischen Röhrchen und waschen mit Kulturmedien Gewebefragmente zu erholen. Zentrifugieren Sie die "Mechanische Distanzierung" Fraktion für 5 min (350 × g, 4 ° C). Entfernen Sie den Überstand aus dem pelle "Mechanical Dissociation" Fraktion und resuspendieren das Gewebe in kaltem Kulturmedien. Wenn es mehr als 5 ml Gewebe in der "Mechanical Dissoziation" konischen Rohr ist, teilen das Gewebe in anderen 50 ml konischen Röhrchen, so dass kein Rohr mehr als 5 ml Gewebe hat. Lagern Sie die mechanisch dissoziierten Fraktion auf Eis, bis der Sucrosegradientenzentrifugation Schritt (Step 5). Alternativ kann die mechanisch dissoziierte Bruch gehen während der enzymatischen Spaltung Inkubationszeit zu Schritt 5 (Schritt 4.4). 4. Enzymatische Dissoziation Wenn es mehr als 5 ml Gewebe in der Röhre ist, die verbleibenden größeren Gewebefragmente enthält, aufgeteilt das Gewebe in andere neue 50 ml konische Röhrchen, so dass kein Rohr mehr als 5 mL Gewebe hat. Zentrifugieren Sie die konische Röhre (n) enthalten, die restlichen Gewebefragmente für 5 min (350 × g, 4 ° C). Entfernen Sie den Überstand und fügen die vorgewärmtem enzymatische Aufschlußlösung, so dass es 5 ml Aufschlußlösung pro 1 mL Gewebe (zB 25 ml Digestionslösung für 5 ml Gewebe). Verschließen Sie die konische Gefäßdeckel mit Laborfilm und brüten die Reaktion auf einem Rotator bei 37 ° C für 30 min. Nach der Inkubation verreiben die Proben vorsichtig (siehe Abbildung 1C). Mit einem 10 ml serologische Pipette,Pipette die Probe auf und ab 6 – 8 mal. Vermeiden Sie übermäßige Luftblasen zu erzeugen. Fügen Sie ein 1000 ul Pipettenspitze bis zum Ende der Pipette und verreiben zusätzlich 6 – 8 mal. Erlauben die verbleibenden Stücke an den Boden des Röhrchens absetzen. Entfernen und filtern den Überstand mit den Zellen noch ein 100 & mgr; m-Filter in ein neues 50 ml konischen Röhrchen mit "Enzymatische Dissoziation" und speichern auf Eis suspendiert durch. Wenn bedeutende Gewebefragmente bleiben, fügen Sie eine zusätzliche 10 ml HBSS mit Calcium und Magnesium zu den Fragmenten und wiederholen Sie die Schritte 3.5.1 und 3.5.2. Filtern endgültige Lösung durch ein 100 & mgr; m-Filter in die "Enzymatische Dissoziation" Rohr. Zentrifugieren Sie die "Enzymatische Dissoziation" Röhrchen 5 min (350 × g, 4 ° C) und weiterhin Sucrosegradientenzentrifugation. 5. Sucrosegradientenzentrifugation Werden die Proben noch in Lösung, centrifu suspendiertge für 5 min (350 · g, 4 ° C). Entfernen des Überstandes und Resuspendieren Gewebe in 20 ml kaltem HBSS ohne Calcium und Magnesium. Bringt Volumen von bis zu 25 ml insgesamt mit kaltem HBSS. Langsam 25 ml Lösung 1,8 M Saccharose hinzufügen und das Rohr invertieren zu mischen. Dies resultiert in einer 0,9 M Sucrose-Gradienten. Zentrifuge ohne Bremsen für 10 min (800 · g, 4 ° C). Verwendung einer Zentrifugation Bremse wird der Gradient stören und die Ausbeute verringern (siehe Figur 1D für ein Beispiel einer Probe vor und nach der Zentrifugation). Sorgfältig absaugen Myelin Trümmer und so viel Saccharose-Lösung wie möglich. Waschen Sie die Probe durch Zugabe von 30 ml kaltem HBSS ohne Calcium und Magnesium und Mischen sanft. Zentrifuge für 5 min (350 · g, 4 ° C). 6. ACK Red Blood Cell Lysis Entfernen Sie den Waschüberstand. Werden 5 ml ACK-Lysepuffer und resuspendieren sanft das Zellpellet, wirbelnde das Röhrchen für 1 min bei RT. Quenche die llyse von 30 ml kaltem HBSS Zugabe ohne Calcium und Magnesium. Zentrifuge für 5 min (350 · g, 4 ° C). 7. Vorkultur Wartung Resuspendieren der endgültigen Zellpellets in 10 bis 15 ml warmem komplette TSM mit Wachstumsfaktoren und zu quantifizieren Lebendzelldichte auf einem Hämozytometer Trypanblau-Ausschluss verwenden. HINWEIS: Der Bereich der lebenden Zellen weit variiert je nach den Umständen des Gewebespende abhängig, und die Quantifizierung kann in diesem frühen Stadium aufgrund Überbleibsel Zelltrümmer schwierig sein. Im Idealfall wollen eine Million lebende Zellen pro Probe zu haben. In Fällen, in denen eine übermäßige Schutt, Platte bei einer geringeren Dichte in einem T175-Kolben bleibt. Übertragen Sie die endgültige Zellsuspensionen auf eine neue T75 Kulturflasche. Spike in zusätzlichen Wachstumsfaktoren jeden zweiten Tag insgesamt Wachstumsfaktor Niveau zu halten und zu überwachen für die Entwicklung von Tumorzellen Neurosphären (siehe Abbildung 1E und Abbildung 2). Alternativ Verfahren enzymatisch dissoziierten Zellen für eine weitere Analyse, einschließlich der Durchflusszytometrie und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung. Nach der Entwicklung der Neurosphären (die im Durchschnitt 3 nimmt – 4 Wochen, aber liegt im Bereich von einigen Tagen bis so lange wie 2 Monate) in umgekehrter Probenfilter 100 & mgr; m Nylonmaschenfilter mit der Menge an Ablagerungen zu verringern. HINWEIS: Das Filtrat sollte in Kultur bei tragfähige einzelne Zellen oder kleine Kugeln vorhanden sind, beibehalten werden. Die Integrität und Reinheit der Kultur durch DNA-Fingerprinting Durchführung während Passagierung auf den Anfangspatientenprobe verglichen wird.