Un protocole pour Rapid Post-mortem Culture cellulaire de Diffuse Intrinsic Pontine gliome (DIPG)

Ce protocole a été réalisée avec l'approbation de notre conseil d'examen institutionnel de-identification appropriée de toutes les données du patient et conformément à toutes les directives institutionnelles, nationales et internationales pour le bien-être humain. Obtenir toutes les institutions d'approbation des commissions d'examen approprié et le consentement éclairé de la famille du patient avant de travailler avec ce protocole. 1. Obtenir des échantillons de tissus NOTE: Un élément essentiel de ce protocole exige une manipulation appropriée du don de tissus à partir immédiatement au moment de l'autopsie. La viabilité globale de l' échantillon dépend de manière significative sur la réduction du Post-Mortem Interval (PMI), transférer immédiatement le tissu dans le milieu froid approprié complété avec des antibiotiques / antifongiques, en gardant l'échantillon sur de la glace tout au long du transport, et le maintien d'une technique stérile tout au long du protocole. Dès la notificationd'un don imminent, préparer un kit de prélèvement d'échantillon. Utilisation d'une boîte d'expédition avec un conteneur isolé qui peut être directement utilisé pour le transport de retour de l'échantillon de tissu, comprennent les matériaux suivants: Inclure des matériaux de préparation stérile, y compris des gants stériles, les rideaux, et scalpels. Inclure 8 – 10 stériles de 50 ml tubes coniques contenant 30 médias d'expédition mL dans le conteneur isotherme avec de la glace ou des compresses froides. NOTE: Bien que tout milieu de culture cellulaire standard peut fonctionner, la meilleure viabilité de l'échantillon est obtenue avec Hibernate-A supplémenté avec un antibiotique / antimycosique. Inclure tous les autres tubes d'échantillons pour d' autres analyses (par exemple, fixatifs). Si l'autopsie ne sera pas effectuée sur le site de l'enquêteur, inclure un document qui indique clairement comment recueillir l'échantillon de tumeur. Cela inclut des détails tels que le maintien de la stérilité, en gardant les tubes échantillons sur de la glace, et y compris des échantillons du mésencéphale et le bulbe rachidien que tumor cellules envahissent souvent ces régions. Maintenir la stérilité lors de l'autopsie. Considérons le cerveau stérile à l'intérieur du crâne, donc observer une technique stérile (y compris les gants changeants) une fois que le crâne est ouvert. Éviter la contamination avec la peau et les cheveux est critique. Disséquer la tumeur de la face ventrale (le "ventre" des pons, voir la figure supplémentaire 1). Avec un scalpel stérile, couper des petits morceaux de 1 cm de la tumeur et transférer immédiatement dans les médias à froid d'expédition (voir NOTE à l'étape 1.1.2) et de mettre sur la glace mouillée. Placer 10 ml de tissu dans chaque tube, résultant en un volume final de tissu et des médias dans chaque tube de 40 ml. NOTE: Dans le cas de DIPG, la tumeur infiltrats diffuse les pons et fréquemment le reste du tronc cérébral. En tant que tel, recueillir autant de l'échantillon que possible, y compris généralement 3 – 4 tubes (30 – 40 ml) de tissus de pons et 1 – 2 tubes (10 – 20 de tissu mL) chacun de mésencéphale et le bulbe rachidien. Collecter samples du mésencéphale et le bulbe rachidien juxtaposée aux pons, qui contiennent souvent de nombreuses cellules tumorales. Après la collecte des échantillons, expédier les échantillons O / N sur la glace mouillée dans le conteneur isolé. Ne pas expédier l'échantillon sur la glace sèche, que le gel va tuer les cellules. 2. Préparation pour le traitement de l'échantillon Avant de commencer la préparation des échantillons, stériliser les hottes de culture de tissus ainsi que des lames de rasoir, hémostatiques courbes, et d'autres outils non stériles sous lumière UV pendant 1 h. Effectuer toutes les étapes suivantes, dans des conditions stériles pour éviter la contamination des cultures. Préparer et solutions de filtration stériles. Pour préparer 1,8 M solution de saccharose, dissoudre 308,07 g de saccharose dans 300 ml d'eau distillée. Ajouter 50 ml de 10x Hank's une solution saline tamponnée Solution (HBSS) sans calcium ni magnésium et amener le volume total à 500 ml avec de l'eau distillée. Conserver à 4 ° C. Pour préparer la solution de digestion enzymatique, prendre 50 ml de HBSS avec du calcium et du magnésium pour chaque 10 ml de tissu haché et ajouter 500 ul de 5 mg / désoxyribonucléase ml I (concentration finale de 50 pg / ml), 500 ul de 2,5 mg / ml de collagénase I / II et de la solution de dispase (concentration finale de 25 ug / ml) et 500 ul 1 M de tampon HEPES. solution de digestion Préchauffer dans un bain d'eau C 37 °. Pour préparer la tumeur tige médias (TSM) de base, mélanger 250 ml Neurobasal-A, de 250 mL Dulbecco Modified Eagle Medium: éléments nutritifs Mélange F12 (DMEM / F12), 5 mL 100x antibiotique-antimycosique, 5 ml 200 mM de L-alanyl-L- dipeptide glutamine (GlutaMAX-A), un tampon HEPES 5 ml, 5 ml de pyruvate de sodium 100 mM, et 5 ml 100x MEM acides aminés non essentiels. Pour préparer complète TSM avec des facteurs de croissance, ajoutez les suppléments suivants à base de TSM: 50x B27 Supplément Minus vitamine A (01h50), facteur de croissance épidermique humain (H-EGF, 20 ng / mL), des fibroblastes humains Growth Factor (H- FGF 20 ng / mL), de l'homme AA facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-H-AA, 10 ng / mL),Dérivé des plaquettes BB du facteur de croissance (H-PDGF-BB, 10 ng / mL) humaines, et une solution d'héparine (2 mg / ml). Prérefroidissement une centrifugeuse de laboratoire équipé d'un rotor oscillant seau à 4 ° C. 3. Mechanical Dissociation Transférer le tissu dans un 100 mm x 20 mm plat haute paroi de culture cellulaire. Retirer les restes de médias de l'expédition et le remplacer par 10 – 15 ml de milieu de culture froide. En utilisant les pinces hémostatiques courbées pour saisir une lame de rasoir, mâche le tissu finement tout en éliminant les vaisseaux sanguins apparents ou meninges. NOTE: Les fragments de tissus finaux devraient être inférieure à 1 mm (voir la figure 1B). Transférer le tissu dans un tube propre mL 50 conique. Laver la boîte de culture cellulaire avec un ml de milieu de culture froid supplémentaires 5 et transférer au tube conique. Répétez cette étape si nécessaire de lavage pour transférer le tissu restant. En utilisant une pipette sérologique de 10 mL, triturer doucement (4 – 5 fois). Autoriser les grandes tissdes fragments Ue par rapport à déposer au fond du tube. Si nécessaire, centrifuger brièvement l'échantillon pendant 1 min (350 x g, 4 ° C). Recueillir la fraction dissociées mécaniquement. Eliminer le surnageant et le filtrer à travers un filtre de 100 um dans un nouveau tube de 50 ml conique étiqueté "dissociation mécanique". Inversez le filtre sur le tube conique originale et laver avec des milieux de culture pour récupérer des fragments de tissus. Centrifuger la fraction "dissociation mécanique" pendant 5 min (350 x g, 4 ° C). Retirer le surnageant de la fraction pastillé "Dissociation mécanique" et resuspendre le tissu dans les milieux de culture froide. S'il y a plus de 5 mL de tissu dans le tube conique "Dissociation mécanique", diviser le tissu dans 50 mL d'autres tubes coniques de telle sorte que le tube ne possède plus de 5 ml de tissu. Stocker la fraction mécaniquement dissociée sur la glace jusqu'à ce que l'étape de centrifugation de gradient de saccharose (Step 5). Alternativement, la fraction mécaniquement dissociée peut passer à l'étape 5 pendant la période d'incubation de dissociation enzymatique (étape 4.4). 4. Enzymatic Dissociation S'il y a plus de 5 ml de tissu dans le tube contenant les fragments de tissus plus gros restants, diviser le tissu dans d'autres nouveaux tubes de 50 ml coniques de telle sorte que le tube ne possède plus de 5 ml de tissu. Centrifuger le tube conique (s) contenant des fragments de tissus restants pendant 5 min (350 x g, 4 ° C). Eliminer le surnageant et ajouter la solution de digestion enzymatique préchauffée, de sorte qu'il y a une solution de digestion de 5 ml pour tous les tissus 1 ml (par exemple, une solution de digestion de 25 ml pour 5 tissu ml). Sceller les couvercles des tubes coniques avec un film de laboratoire et laisser incuber la réaction sur un agitateur à 37 ° C pendant 30 min. Après l'incubation, triturer les échantillons doucement (voir figure 1C). En utilisant une pipette sérologique de 10 mL,pipette l'échantillon et en baisse de 6 – 8 fois. Éviter de générer des bulles d'air excessives. Ajouter une pointe de pipette de 1000 pi à la fin de la pipette et triturer un supplément de 6 – 8 fois. Autoriser tous les morceaux restants de se déposer au fond du tube. Retirer et filtrer le surnageant avec les cellules encore en suspension à travers un filtre de 100 um dans un nouveau tube de 50 ml conique étiqueté "Enzymatic Dissociation" et de stocker sur la glace. Si des fragments de tissus importants demeurent, ajouter un supplément de 10 ml de HBSS avec le calcium et le magnésium pour les fragments et répéter les étapes 3.5.1 et 3.5.2. Filtrer cette solution finale à travers un filtre de 100 um dans le tube "Enzymatic Dissociation". Centrifuger le tube "Dissociation enzymatique" pendant 5 min (350 x g, 4 ° C) et continue à gradient de saccharose par centrifugation. 5. gradient de saccharose Centrifugation Si les échantillons sont toujours suspendues en solution, centrifuge pendant 5 min (350 x g, 4 ° C). Retirer le tissu du surnageant et remettre en suspension dans 20 ml de HBSS froid, sans calcium ni magnésium. Amener le volume à 25 ml au total avec HBSS froid. Ajouter lentement 25 M mL 1,8 solution de saccharose et le tube pour mélanger. Il en résulte un gradient de 0,9 M de saccharose. Centrifuger sans frein pendant 10 min (800 x g, 4 ° C). L' utilisation d' un frein de centrifugation va perturber le gradient et réduire le rendement (voir la figure 1D pour un exemple d'un échantillon avant et après centrifugation). Aspirer soigneusement les débris de myéline et autant une solution de saccharose que possible. Laver l'échantillon en ajoutant 30 mL froid HBSS sans calcium et de magnésium et en mélangeant doucement. Centrifuger pendant 5 min (350 x g, 4 ° C). 6. ACK globules rouges Lysis Retirer le surnageant de lavage. Ajouter un tampon de lyse ACK 5 ml et remettre en suspension doucement le culot cellulaire, fait tourner le tube pendant 1 min à température ambiante. Stopper la lyse en ajoutant 30 mL froid HBSS sans calcium et le magnésium. Centrifuger pendant 5 min (350 x g, 4 ° C). 7. Initial Maintenance Culture Remettre en suspension les culots cellulaires finales dans 10 – 15 ml chaud complet TSM avec des facteurs de croissance et de quantifier la densité de cellules viables sur un hémocytomètre en utilisant l'exclusion du bleu trypan. NOTE: La gamme de cellules viables est très variable selon les circonstances du don de tissus, et la quantification peut être difficile à ce stade précoce en raison de débris cellulaires restants. Dans un cas idéal, le but d'avoir un million de cellules vivantes par échantillon. Dans le cas où un excès de débris reste, la plaque à une densité inférieure dans un flacon T175. Transférer les suspensions cellulaires finales dans un nouveau flacon de culture T75. Pic de facteurs de croissance supplémentaires tous les jours pour maintenir le niveau global du facteur de croissance et de surveiller le développement de neurosphères de cellules tumorales (voir la figure 1E et figure 2). Sinon, le processus des cellules dissociées enzymatiquement pour une analyse plus poussée, y compris de cytométrie en flux et tri cellulaire activé par fluorescence. Après le développement de neurosphères (qui prend en moyenne 3 – 4 semaines, mais varie de quelques jours à tant que 2 mois), le filtre inverse l'échantillon en utilisant un filtre à mailles de nylon de 100 um pour réduire la quantité de débris. NOTE: Le filtrat doit être maintenu dans la culture en cas des cellules individuelles viables ou de petites sphères sont présentes. Assurer l'intégrité et la pureté de la culture en réalisant des empreintes génétiques tout en repiquage, en comparant à l'échantillon initial du patient.