بروتوكول للثقافة السريع بعد الوفاة خلية من منتشر الجوهرية جسري بالورم الدبقي (DIPG)
Summary
يصف هذا البروتوكول وسيلة لتجهيز سريع لمرحلة ما بعد الوفاة منتشر عينات جسري الورم الجوهرية لإنشاء نماذج زراعة الخلايا المشتقة من المريض أو توصيف المباشر للخلايا السرطانية وmicroenvironmental.
Abstract
منتشر الجوهرية جسري بالورم الدبقي (DIPG) هي مرحلة الطفولة ورم الدماغ الذي يحمل التكهن قاتلا عالميا. لأن الاستئصال الجراحي ليس استراتيجية العلاج قابلة للحياة ولم يتم تنفيذ خزعة بشكل روتيني، وتوافر عينات المريض للبحوث محدودة. ونتيجة لذلك، تم الطعن الجهود في دراسة هذا المرض عن طريق ندرة النماذج مرض المؤمنين. لتلبية هذه الحاجة، ونحن هنا وصف بروتوكول لتجهيز سريع لمرحلة ما بعد الوفاة عينات نسيجية مأخوذة من أجل توليد نماذج زراعة الخلايا المشتقة من المريض متينة والتي يمكن استخدامها في فحوصات في المختبر أو في التجارب المجراة طعم أجنبي مثلي. هذه النماذج يمكن استخدامها للكشف عن الأهداف المحتملة المخدرات ولدراسة العمليات pathobiological الأساسية داخل DIPG. يمكن كذلك بمد هذا البروتوكول لتحليل وعزل الخلايا السرطانية وmicroenvironmental باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS)، التي تمكن من تحليل لاحق من السابق الجينالضغط ووالتعبير البروتين، أو إدخال تعديلات جينية من الحمض النووي في الخلية بكميات كبيرة أو مستوى خلية واحدة. وأخيرا، وهذا البروتوكول يمكن أيضا أن تتكيف لتوليد الثقافات المستمدة من المريض لعلاج أورام الجهاز العصبي المركزي أخرى.
Introduction
DIPG هي المركزي خبيثة الجهاز العصبي العدواني الذي يطرح نفسه في بونس بطني، وعادة خلال منتصف مرحلة الطفولة 1 و 2. وعلى الرغم من عقود من التجارب السريرية، والعلاج الحالي يقتصر على العلاج الإشعاعي، التي تنص على تحسن مؤقت أو استقرار الأعراض وتمتد فقط متوسط بقاء بمعدل 3 أشهر. حتى مع العلاج الإشعاعي، متوسط البقاء الإجمالي هو 9 أشهر فقط مع 90٪ من الأطفال الذين يموتون من المرض في غضون 2 عاما من التشخيص الأولي. بسبب طبيعة الارتشاحي من الورم وظائف الحرجة من الدماغ، استئصال الجراحي غير ممكن. وعلاوة على ذلك، في الولايات المتحدة، تاريخيا لم يتم إجراء الحصول على الخزعات الجراحية لDIPG 3، وتحليل الأنسجة ليس له دور الحالي في توجيه العلاج السريري والتشخيص وعادة ما يمكن أن تقدمه تصوير الأعصاب وحدها. وهكذا، فإن توافر ورم الأنسجة وأو يقتصر الدراسة، مما يحد من جهود لإجراء البحوث على جزيئات الدواء مرشح وبيولوجية الورم الأساسي. والجدير بالذكر أن سمحت التحسينات في تقنيات التصوير العصبي والمجسم لتطوير الخزعات الآمنة للDIPG في السنوات الأخيرة 4، والتي تشكل مجتمعة مع التقدم في البيولوجيا الجزيئية، حولت فهمنا للمرض. حاليا، والتجارب السريرية متعددة باستخدام خزعة مقدما والتنميط الجزيئي للDIPG لإضفاء الطابع الشخصي خطط العلاج هي مستمرة (NCT01182350، NCT02274987) 5.
DIPG وغيرها من الأطفال الاورام الدبقية عالية الجودة تمثل الأمراض تختلف عن نظيراتها ورم أرومي الكبار 6 و 7 و نماذج تجريبية وبالتالي المؤمنين DIPG ضرورية لفهم الفيزيولوجيا المرضية فريدة من نوعها واكتشاف استراتيجيات علاجية فعالة. في السنوات الأخيرة، ركزت الجهود للحصول على DIPG الورم رقضية للأبحاث في وقت تشريح الجثة أو، أقل شيوعا، خزعة أحدثت ثورة في فهمنا لوالقدرة على دراسة DIPG. وكشفت جهود تسلسل الجينوم على نطاق طفرة المتكررة في هيستون H3، 3A الأسرة (H3F3A) ومجموعة هيستون 1، H3B (HIST1H3B)، وهو ما يمثل أول مثال من الأمراض التي تصيب البشر التي تسببها طفرات في هيستون ترميز البروتينات 8، 9، 10، 11 . وعلاوة على ذلك، مجموعة فرعية من DIPGs تعبر عن طفرات في الجين ACVR1، التي لم يسبق ذكرت في السرطان ولكن متطابقة إلى حدوث طفرات وجدت في مرحلة الطفولة الخلقية التنموي اضطراب خلل التنسج الليفي المعظم المترقي 8، 9، 10، 11. كذلك، أول مزارع الخلايا DIPG المستمدة من المريض ومثلي مو طعم أجنبيوقد ثبت الآن ديل 1، 2، 12، 13، 14، وكذلك نماذج الماوس التي أنشئت من خلال زرع الأعضاء المباشر للخلايا السرطانية في الفئران العوز المناعي لتوليد xenografts مسلسل 3، 14، 15. وقد حددت الأولية جهود فحص المخدرات باستخدام هذه النماذج المستمدة من المريض وكلاء رواية واعد للترجمة السريرية 4 و 14 و قد وضعت الأساس لتجربة سريرية واحدة على الأقل (NCT02717455).
هذه الخطوات الأولى نحو التقدم ليست سوى البداية، وسوف العديد من عينات الأنسجة المستمدة من المريض ونماذج ثقافة يكون من الضروري تعريف أنواع فرعية من المرض وتطوير استراتيجيات علاجية أكثر فعالية. وراثيا المحركسوف نماذج الماوس الدو من DIPG تسهل أيضا الدراسات التي تهدف إلى تعزيز فهمنا الأساسي للمرض. سيتم ساعدت الجهود التي بذلت لتوليد نماذج وراثية لDIPG من الدراسات الجينومية التأسيسية التي نوقشت أعلاه، ولكن في الوقت الحاضر عدد محدود من الخيارات المتاحة. واحدة من هذه النموذج الذي يولد مماثلة تشريحيا الاورام الدبقية جذع الدماغ عالية الجودة، ويستخدم الفيروس تقييمات النتائج والكفاءات / التلفزيون نظام لدفع overexpression PDGF-B وفقدان Ink4a-ARF في الخلايا nestin إيجابي في الحفرة الخلفية من الفئران حديثي الولادة 5، 16. وتتضمن مقاربة أخرى تلخص عدة طفرات الرئيسية المرتبطة DIPG (هيستون H3.3 K27M الطفرة، وفقدان البروتين p53 وتفعيل PDGFRA) في الخلايا العصبية السلائف المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، وهو ما يكفي لجعل هذه الخلايا مكون للأورام 6 و 7 و 17. مزيج من الأساليب الوراثية والمريض الاوعيةسوف نماذج الطبعة تمكين اختبار قبل السريرية ويعزز تطوير علاجات فعالة.
لمعالجة التحديات التي تواجه البحوث DIPG المفصلة أعلاه، وقد تم تطوير هذا البروتوكول التشريح السريع لتوليد مزارع الخلايا المشتقة من المريض للتحقيق 8، 9، 10، 11، 12، 14. ويهدف البروتوكول إلى حماية سلامة الأنسجة وزيادة احتمال توليد الثقافات دائمة على الرغم من التحديات المرتبطة فترات ما بعد الوفاة طويلة ووقت النقل. عندما ولدت بنجاح، هذه الثقافات DIPG يمكن استخدامها في المختبر في التلاعب اللاحقة وفي التجارب المجراة طعم أجنبي، مما يسمح لتقييم الجزيئات العلاجية المحتملة على الخلايا المشتقة من المريض.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسيلة لتجهيز سريع لمرحلة ما بعد الوفاة التبرعات أنسجة الورم لتطوير مزارع الخلايا المشتقة من المريض، والتي يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من في المختبر أو في التجارب المجراة. ونظرا لطبيعة العمل مع عينات التشريح، والحفاظ على استمرارية عينة يشكل تحديا كبيرا. العديد من العوامل المساهمة، بما في ذلك فترة ما بعد الوفاة لتشريح أو الوقت اللازم لنقل الأنسجة، وينبغي التقليل قدر الإمكان ولكن من الصعب التحكم في كثير من الأحيان. في تجربتنا، والفترة التالية للموت من أقل من 6-8 ساعة (من وقت الموت إلى الوقت الذي يتم وضع الأنسجة في الجليد الشحن البارد وسائل الاعلام وسائل النقل) قد حقق أفضل فرصة لإرساء ثقافة خلية دائمة. فمن الأفضل لثم تظهر الأنسجة في المختبر خلال 24 ساعة، ومعالجته للثقافة فور استلامها.
منذ الموقع من هذه الحالات نادرة يختلف على نطاق واسع، ونوعية خطوة استرجاع الأنسجة تؤثر بقوة على فرصة للنجاح، والخدمات اللوجستية على أداء تشريح الجثة يمكن أن يكون تحديا. في كثير من الحالات، من أجل تحقيق الإطار الزمني 6-8 ساعة، فإنه ليس من الممكن إجراء الحصاد الأنسجة في مركز الأكاديمي. بدلا من ذلك، وجود خدمة استعادة الأنسجة على الدعوة إلى استعادة الأنسجة السرطانية في جنازة الوطن في إطار بروتوكول افق الاتحاد الدولي للرجبي في كثير من الأحيان أكثر المناسب لاستعادة الأنسجة. الحصول على الموافقة المسبقة قبل الموت الموصى بها ويسهل التخطيط اللوجستي. إعداد مجموعات التشريح مكتفية ذاتيا مع تعليمات واضحة وشاملة واللوازم معقمة لاسترجاع الأنسجة (القفازات، والستائر، المشارط) ويوصى بشدة. بالإضافة إلى ذلك، وإنشاء نقاط اتصال واضحة بين المحقق، الطبيب الشرعي، وجنازة الوطن أمر بالغ الأهمية. على سبيل المثال، ينبغي للمحقق مناقشة بروتوكول مع الطبيب الشرعي قبل التشريح وتسليط الضوء على الأخطاء الشائعة. وتشمل هذه الأخطاء الصغيرةتلوث بيال (عادة الخميرة) خلال استرجاع الأنسجة، وفشل لشحن عن طريق الشحن بين عشية وضحاها / المعجل وفشل لشحن عينة على الجليد الرطب كافية في وعاء thermoinsulated. وأخيرا، فإننا نوصي باستخدام خدمة البريد السريع من الباب إلى الباب للشحن من العينة إلى تقليل الوقت اللازم للنقل.
وينبغي أيضا توخي الحذر أثناء تفكك الأنسجة للحفاظ على بقاء الخلية. على سبيل المثال، استخدام وسائل الإعلام تهدف إلى الحفاظ على صحة الأنسجة العصبية للنقل (السبات-A تستكمل مع المضادات الحيوية / مضاد فطري) سيزيد من فرصة لتوليد ثقافة ناجحة. ومن المهم أيضا للحفاظ على العينة في درجة حرارة باردة في جميع أنحاء البروتوكول عن طريق نقل دائما العينات على الجليد. جمع الصورتين تفارق الميكانيكية والأنزيمية جنبا إلى جنب مع التقليل من سحن يمكن أن تحسن نجاح البروتوكول، على حد سواء الخطوات هي مؤلمة للخلايا. في تجربتنا، في حين تنمو معظم الثقافات الناجحة من الصورتين، كان لدينا الحالات التي أنشئت واحد فقط من التحضيرات اثنين ثقافة دائمة، ويحتمل أن يعكس الطبيعة الحساسة لهذه العينات. خطوة مؤلمة أخرى في البروتوكول هو سحن. استراتيجية واحدة التي يمكن أن تقلل من درجة سحن الضروري هو ضمان مفروم العينات بدقة في بداية التحضير. وهناك أمثلة أخرى من جوانب البروتوكول يهدف إلى تحسين قابلية عينة مضيفا مخازن (على سبيل المثال، HEPES) في جميع أنحاء بروتوكول، وهو أمر بالغ الأهمية خلال تفارق الأنزيمية.
وهناك تعديل ممكن من هذا البروتوكول إلى زيادة قابلية الخلية هو إزالة الدم الحمراء خطوة خلية تحلل ACK. ومع ذلك، في هذه الحالة، غالبا ما يكون ذلك ضروريا لأداء خطوة ACK تحلل خلال الأسبوع الأول في الثقافة لإزالة خلايا الدم الحمراء. جانب آخر من هذا البروتوكول التي يجوز تعديلها هو القضاء على المايلين والحطام الخلوي باستخدام كثافه السكروزذ التدرج. على وجه التحديد، والاستراتيجيات الأخرى التي تم الإبلاغ عنها لتحسين بقاء الخلية من خلايا دبقية صغيرة من الممكن أيضا في هذه الخطوة، مثل متقطع Percoll كثافة التدرج 18 او الخرز إزالة المايلين المغناطيسية.
وأخيرا، فإن مدة بين تفكك النسيج الأولي وظهور neurospheres اختلافا بين عينات ويمكن أن تتخذ في أي مكان من أسبوع إلى شهر أو أكثر. منذ الثقافات الأولية تحتوي عادة على درجة كبيرة من الخلايا الميتة والبقايا الخلوية، فإنه يمكن أن يكون تحديا لتحديد ما إذا كانت الخلايا قابلة للحياة تبقى. ينبغي الحفاظ على ثقافة لا يقل عن 4 – 8 أسابيع (الشكل 2). استراتيجية واحدة لعزل خلايا متزايدة من الحطام المتبقي يرد هنا (أي عكس تصفية مجموعات الخلايا وإعادة الطلاء في وسائل الإعلام الطازج). قرار حول ما إذا كان سيستمر في الحفاظ على الثقافة هو في نهاية المطاف قرار كل حالة على حدة بناء على العوامل المحيطة عشرالبريد تشريح الجثة (على سبيل المثال، وهي الفترة التالية للموت لفترة طويلة، والقضايا أثناء النقل الأنسجة)، وتفكك النسيج (على سبيل المثال، الدم المفرط أو الحطام)، وكيف تظهر العينة في الثقافة. مرة واحدة يتم تأسيس ثقافة، يجب أن يتم التحقق من صحة الهوية عن طريق بصمة الحمض النووي باستخدام القصير تحليل جنبا إلى جنب تكرار أو طريقة مماثلة، ويقارن بين الثقافة لعينة من الورم الأصلي الاحتفاظ بها لهذا الغرض. نوصي التحقق بشكل روتيني الثقافات التي كتبها بصمة الحمض النووي للتأكد من عدم وجود تلوث من الثقافات الأخرى حدث، على سبيل المثال كل 3-6 أشهر.
جيل من هذه الثقافات DIPG المستمدة من المريض يمثل خطوة هامة في التنمية الناجحة للعلاجات فعالة. سوف توسع من النماذج المستمدة من المريض الثقافات DIPG وطعم أجنبي المتاحة ستكون حاسمة في تحديد الاستراتيجيات العلاجية الأكثر فاعلية والتغلب في نهاية المطاف هذا المرض المدمر.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
والكتاب الامتنان بدعم من مؤسسة كلير ماكينا، المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS K08NS070926 وR01NS092597)، وزارة الدفاع (NF140075)، معهد كاليفورنيا للالطب التجديدي (CIRM RB4-06093 وRN3-06510)، عصير الليمون اليكس تقف المؤسسة، والعلاج يبدأ الآن مؤسسة وDIPG التعاونية، ومؤسسة ليلى النصولي، كشف أطفال السرطان، مؤسسة استئصال ورم من الدماغ في مرحلة الطفولة، ومؤسسة ماثيو لارسون، مؤسسة V، صندوق عائلة غودفري في ذاكرة فيونا بينيلوب، ومؤسسة ايلاندز فيلار DIPG، ديلان جويت ، كونور جونسون، زوي غانيش، ديلان فريك، الوصيفة جنسن، وصناديق التذكارية كرانز جنيفر، مؤسسة N8، فيرجينيا وDK صندوق لودفيج لأبحاث السرطان، معهد بحوث صحة الطفل في جامعة ستانفورد آن ت وروبرت باس هبوا كلية للمنح الدراسية في طب الأطفال السرطان وأمراض الدم.
Materials
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco | 24020-117 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Liberase DH (Collagenase/Dispase) | Roche | 5401054001 | |
| DNAse I | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| Neurobasal-A | Gibco | 10888-022 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| GlutaMAX-I (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| B27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Human PDGF-AA | Shenandoah Biotechnology | 100-16 | |
| Human PDGF-BB | Shenandoah Biotechnology | 100-18 | |
| Human EGF | Shenandoah Biotechnology | 100-26 | |
| Human FGF | Shenandoah Biotechnology | 100-146 | |
| Sterile scalpel blades | Bard Paker | 372610 | |
| Curved hemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| 100 x 20 mm cell culture dish | Corning | 353003 | |
| Sterile forceps | TWD Tradewinds | DF8988-5 | |
| Sterile drapes | 3M | 2037 | |
| Sterile gloves | Kimberly Clark | 1182307 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| 100 micron mesh filter | Fisher | 352360 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 1495949A |
References
- Fisher, P. G., et al. A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities. Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).
- Johung, T. B., Monje, M. Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic. Curr. Neuropharmacol. , (2016).
- Cage, T. A., et al. Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children. Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas. Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Kieran, M. W. Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).
- Sturm, D., et al. Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge. Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).
- Jones, C., Baker, S. J. Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma. Nat. Rev. Cancer. , (2014).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).
- Wu, G., et al. The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma. Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).
- Fontebasso, A. M., et al. Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma. Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).
- Buczkowicz, P., et al. Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating. Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).
- Monje, M., et al. Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).
- Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).
- Grasso, C. S., et al. Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Med. , 1-10 (2015).
- Shu, Q., et al. Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma. Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).
- Becher, O. J., et al. Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma. Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).
- Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation. Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
