びまん性内因橋膠腫の迅速な死後の細胞培養のためのプロトコル（DIPG）

このプロトコルは、すべての患者データの適切な脱識別とし、人間の福祉のためのすべて、機関、国、国際的なガイドラインに基づいて、当社の倫理審査委員会の承認を得て行われています。患者の家族から事前にこのプロトコルでの作業に適切なすべての施設内倫理委員会の承認とインフォームドコンセントを取得します。 1.取得組織サンプル注：このプロトコルの重要なコンポーネントは、剖検時に直ちに開始する組織の寄付の適切な取り扱いを必要とします。サンプル全体の生存率は、すぐに抗生物質/抗真菌剤を補充した適切な寒培地に組織を移す、死後間隔（PMI）を最小輸送中濡れた氷の上にサンプルを維持し、プロトコルを通して滅菌技術を維持することに大きく依存しています。 通知されると差し迫った寄付の、サンプル採取キットを準備します。直接組織サンプルの戻り輸送のために使用することができる断熱容器と梱包箱を使用して、以下の物質が含まれます。 滅菌手袋、ドレープ、およびメスを含む無菌調製のための材料を含みます。 氷や冷たいパックと断熱容器に30mLの出荷メディアを含む10の滅菌50 mLコニカルチューブ – 8が含まれます。 注：任意の標準的な細胞培養培地が動作することができますが、最高のサンプルの生存率は、抗生物質/抗真菌を補ったのHibernate-Aを用いて得られます。 他の分析（ 例えば、固定剤）のための任意の更なるサンプルチューブが含まれます。 剖検は、研究者のサイトで実行されない場合は、明らかに腫瘍サンプルを収集する方法を述べた文書が含まれます。これは、このような、無菌性を維持する湿った氷上でサンプルチューブを保持し、TUとして中脳及び延髄からのサンプルを含む、などの詳細が含まれてMOR細胞は、しばしば、これらの領域に侵入します。 剖検時の無菌性を維持します。頭蓋内部の無菌脳を考えるので、頭蓋骨を開いたら（変更手袋を含む）を滅菌技術を観察します。肌や髪の混入を避けることが重要です。 （橋の「腹」、 補足図1を参照）腹側から腫瘍を解剖。滅菌メスで、腫瘍から小さな1cmの塊をカットし、すぐに冷たい出荷メディアに転送する（ステップ1.1.2で注意を参照）、濡れた氷の上に置きます。 40ミリリットルの各チューブ内の組織やメディアの最終容量で、その結果、各チューブに組織を10mLを置きます。 注：DIPGの場合では、腫瘍はびまん性脳橋と頻繁に脳幹の残りの部分に浸透します。橋から – （40 mLの組織30）と1から4のチューブ – 中脳および髄質から – （20 mLの組織10）各2チューブのような、典型的には3を含め、可能な限りサンプルをできるだけ多く集めます。 SAMを収集中脳および髄質からplesは、多くの場合、多くの腫瘍細胞が含まれている橋に並置されました。 サンプル採取後、断熱容器に濡れた氷の上のサンプルO / Nを出荷。凍結が細胞を殺すように、ドライアイス上のサンプルを出荷しないでください。 サンプル処理のため2.準備試料の調製を開始する前に、1時間、UV光下でカミソリ刃、湾曲止血剤、および他の非滅菌ツールと共に組織培養フードを滅菌します。文化の汚染を防止するために、無菌条件下で、以下の手順をすべて実行します。 準備し、滅菌フィルターソリューションを提供しています。 1.8 Mのショ糖溶液を調製し、300 mLの蒸留水中に308.07グラムのスクロースを溶解させます。カルシウムまたはマグネシウムを含まない50mLの10倍Hank's緩衝食塩液（HBSS）を加え、蒸留水を用いて500 mLの総容量をもたらします。 4℃で保存。 酵素消化溶液を調製し、5を取ります細分化した組織のすべての10 mLのためのカルシウムとマグネシウムと 0 mLのHBSSおよびI（最終濃度を50μg/ mL）を、500μLの2.5mg / mLのコラゲナーゼI / IIおよびディスパーゼ溶液（最終濃度25 500μLを5mg / mLのデオキシリボヌクレアーゼを追加μgの/ mL）に溶解し、500μLの1 M HEPES緩衝液。 37℃の水浴中でPrewarm消化溶液。 腫瘍幹メディア（TSM）ベースを準備するには、250ミリリットルたNeurobasal-A、250 mLのダルベッコ改変イーグル培地を混ぜる：栄養混合F12（DMEM / F12）、5 mLの100倍の抗生物質 – 抗真菌、5 mLの200 mMのL-アラニル-1-グルタミンジペプチド（グルタマックスA）、5mLのHEPESバッファー、5mLの100mMのピルビン酸ナトリウム、および5 mLの100×MEM非必須アミノ酸。 TSMベースに以下のサプリメントを追加し、成長因子と完全なTSMを準備するには：50×B27サプリメントマイナスビタミンA（1：50）、ヒト上皮成長因子（H-EGF、20 ngの/ mL）を、ヒトの線維芽細胞増殖因子（H- FGF、20 ngの/ mL）を、ヒト血小板由来増殖因子AA（H-PDGF-AA、10ng / mLの）ヒト血小板由来成長因子BB（H-PDGF-BB、10ng / mLの）、およびヘパリン溶液（2 / mlの）。 4°Cにスイングバケットローターを装備した遠沈管を予冷。 3.機械的解離高壁100ミリメートルX 20ミリメートルの細胞培養皿に組織を転送します。出荷からメディアの残りを削除し、10と交換 – 15 mLの冷たい培養培地。 明らかな血管や髄膜を除去しながらカミソリの刃を把握するために湾曲した止血剤を使用して、細かく組織をミンチ。 注：最終的な組織断片を1mm未満であるべきである（ 図1B参照）。 きれいな50 mLコニカルチューブに組織を移します。さらに5 mLで細胞培養皿を洗う冷たい培養培地およびコニカルチューブに移します。残りの組織を転送するために、必要に応じて、この洗浄ステップを繰り返します。 （ – 5回4）10 mLの血清学的ピペットを用いて、優しくを粉砕します。より大きなTISSを許可しますチューブの底に沈殿するようにUEの断片。必要であれば、簡単に1分（350×gで、4°C）のためのサンプルを遠心します。 機械的に分離画分を収集します。 上清を除去し、標識された新しい50 mLコニカルチューブに100μmのフィルターを通してそれをフィルタリングする「機械的解離。」元のコニカルチューブの上にフィルタを反転し、組織片を回収する培地で洗浄します。 5分間遠心（350×gで、4℃）のための「機械的解離」分数。 ペレット化した「機械的解離」画分から上清を除去し、冷たい培養培地で組織を再懸濁します。 「機械的解離 "コニカルチューブ内の組織のより5mLの存在する場合は、チューブがより5mLの組織を有していないように、他の50 mLコニカルチューブに組織を分割します。 ショ糖勾配遠心分離工程まで氷の上で機械的に解離した分画を保存（スイートP 5）。代わりに、機械的に解離した画分を酵素的解離のインキュベーション期間（ステップ4.4）の間にステップ5に進むことができます。 4.酵素的解離残りのより大きな組織フラグメントを含むチューブ内の組織の5つ以上mLである場合、チューブはより5mLの組織を有していないように、他の新しい50 mLコニカルチューブに組織を分割します。 遠心5分（350×gで、4℃）のために残りの組織フラグメントを含むコニカルチューブ（単数または複数）。 上清を除去し、予め温め酵素消化液を追加し、すべての1mLの組織（5 mLの組織のための例えば、25 mLの消化液）のための5 mLの消化液が存在するように。 実験用フィルムでコニカルチューブの蓋を密封し、37℃で30分間ローテータで反応をインキュベートします。 インキュベーション後、（ 図1C参照）静かにサンプルを粉砕します。 10mLの血清学的ピペットを使用して、ピペットサンプルアップと6ダウン​​ – 8回。過剰な気泡を発生させることは避けてください。 ピペットの先端に千μLのピペットチップを追加し、追加の6粉砕する – 8回。 残りのチャンクは、チューブの底に沈殿することを可能にします。削除し、まだ "酵素的解離」と表示された新しい50 mLコニカルチューブに100μmのフィルターに通して懸濁した細胞と上清をフィルタリングし、氷上で保存します。 大幅な組織断片が残っている場合、フラグメントへのカルシウムとマグネシウムでさらに10 mLのHBSSを追加し、ステップ3.5.1と3.5.2を繰り返します。 「酵素的解離」チューブに100μmのフィルターに通して、この最終溶液をフィルタリングします。 5分（350×gで、4°C）のための「酵素的解離」チューブを遠心し、ショ糖勾配遠心分離に進みます。 5.ショ糖勾配遠心サンプルは依然として溶液中に懸濁されている場合、centrifu5分（350×gで、4°C）のためのGE。 カルシウムとマグネシウムを含まない20 mLの冷HBSSで上清と再懸濁組織を削除します。冷HBSS 25 mLの合計にボリュームを起動します。 ゆっくりと25 mLの1.8 Mショ糖溶液を添加し、混合するためにチューブを反転。これは、0.9 Mショ糖勾配になります。 10分（800×gで、4°C）のためのブレーキなしで遠心分離します。遠心分離のブレーキを使用して（遠心分離前と後の試料の例については、 図1Dを参照）の勾配を破壊し、歩留まりを低下させます。 慎重ミエリン破片とできるだけ多くの蔗糖液を吸引します。カルシウムとマグネシウムを含まない30 mLの冷HBSSを添加し、穏やかに混合することにより、サンプルを洗ってください。 5分（350×gで、4℃）遠心します。 前記ACK赤血球溶解洗浄上清を取り除きます。 5mLのACK溶解緩衝液を添加し、穏やかに細胞ペレットを再懸濁し、室温で1分間チューブを旋回。 リットルをクエンチカルシウムとマグネシウムを含まない30 mLの冷HBSSを追加することによりysis。 5分（350×gで、4℃）遠心します。 7.初期文化のメンテナンス成長因子と暖かい完全TSM 15 mLおよびトリパンブルー排除を使用して、血球計数器で生細胞密度を定量 – 10で、最終的な細胞ペレットを再懸濁します。 注：生細胞の範囲が広く組織の寄付の状況に応じて変化し、定量化が原因で残りの細胞の破片に、この初期の段階では困難な場合があります。理想的なケースでは、サンプルごとに百万生細胞を持つことを目指しています。過度のデブリは、T175フラスコ中の低密度でプレートのまま例中。 新しいT75培養フラスコに、最終的な細胞懸濁液を転送します。 （ 図1Eおよび図2を参照）全体の成長因子レベルを維持し、腫瘍細胞のニューロスフェアの開発を監視するために一日おきに追加の成長因子でスパイク。 また、プロセスフローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞選別を含めたさらなる分析のために酵素的に解離した細胞を、。 （平均で3取る – 4週間、しかし限り、2ヶ月に数日の範囲）ニューロスフェアの現像後、破片の量を減らすために、100μmのナイロンメッシュフィルターを使用してサンプルフィルタを逆にします。 注：ろ液を、生存単一細胞または小さな球が存在する場合に、培養物中に維持されるべきです。 最初の患者サンプルと比較し、継代しながら、DNAフィンガープリンティングを行うことにより、文化の完全性と純度を確認してください。