Протокол для быстрой Посмертное культуре клеток диффузной Характеристическая Понтийской глиомы (DIPG)
Summary
Этот протокол описывает метод для быстрой обработки посмертных диффузных собственных образцов мостовое глиомы для создания моделей клеточных культур пациента, полученных или прямой характеристике опухолевых и микроокружения клеток.
Abstract
Диффузный искробезопасности Понцианские глиомы (DIPG) представляет собой опухоль ствола головного мозга в детстве, что влечет за собой универсально фатальный прогноз. Поскольку хирургическое удаление не является жизнеспособной стратегией лечения и биопсия обычно не выполняется, наличие клинических образцов для исследований ограничено. Следовательно, усилия по изучению этого заболевания была поставлена под сомнение скудность верных моделей заболеваний. Чтобы удовлетворить эту потребность, мы опишем здесь протокол для быстрой обработки посмертных образцов аутопсии ткани с целью создания прочных моделей культуры клеток пациента , полученных , которые могут быть использованы в анализах ин витро или ин виво ортотопических экспериментах ксенотрансплантатов. Эти модели могут быть использованы для скрининга потенциальных мишеней для лекарственных средств и изучения фундаментальных процессов в рамках pathobiological DIPG. Этот протокол может быть дополнительно расширен, чтобы анализировать и изолировать опухолевых и микроокружения клеток с использованием флуоресцентно-активированных клеток сортировки (FACS), что позволяет последующий анализ гена ехприжимное, экспрессия белка или эпигенетические модификации ДНК в объемном клетки или уровне одной клетки. И, наконец, этот протокол также может быть выполнен с возможностью генерации пациента, полученных культур для других опухолей центральной нервной системы.
Introduction
DIPG является агрессивной центральной нервной системы злокачественности , которая возникает в вентральной мосте, как правило , в течение середины детства 1, 2. Несмотря на десятилетия клинических испытаний, в настоящее время обработка ограничивается лучевой терапией, которая обеспечивает временное улучшение или стабилизация симптомов и только увеличивает медиану выживаемости в среднем на 3 месяца. Даже при лучевой терапии, медиана общей выживаемости составляет всего 9 месяцев с 90% детей, умирающих от этого заболевания в течение 2 лет первоначального диагноза. Из-за инфильтративного характера опухоли и критические функции ствола головного мозга, хирургическое удаление не представляется возможным. Кроме того, в Соединенных Штатах, получение хирургических биопсий для DIPG исторически не была выполнена 3, поскольку гистопатологическая анализ не имеет текущую роль в руководстве клинического лечения и диагностики , как правило , могут быть сделаны с помощью нейровизуализации в одиночку. Таким образом, наличие опухоли ткани Fили исследование ограничено, что ограничивает усилия по проведению исследований по защите кандидатских молекул лекарственного вещества и основной биологии опухоли. Следует отметить, что улучшения в нейровизуализации и стереотаксической техники позволили для разработки безопасных биопсий DIPG в последние годы 4, которые, в сочетании с достижениями в области молекулярной биологии, которые изменили наше представление о болезни. В настоящее время многочисленные клинические испытания с использованием авансовый биопсии и молекулярно – профилирование DIPG для индивидуализацию планов лечения продолжается (NCT01182350, NCT02274987) 5.
DIPG и другие педиатрические глиомы высокого класса представляют различные заболевания от своих взрослых коллег глиобластомы 6, 7, и , таким образом , верные экспериментальные модели DIPG необходимо понять его уникальный патофизиологии и открыть для себя эффективные терапевтические стратегии. В последние годы целенаправленные усилия по получению опухоли DIPG твопрос для исследования во время аутопсии или, реже, биопсия реконструировали наше понимание и способность к обучению DIPG. Всему геному усилия секвенирования выявили рецидив мутации в гистона Н3, семейство 3A (H3F3A) и гистонов кластера 1, H3b (HIST1H3B), представляющий собой первый пример человеческого заболевания , вызванного мутацией в гистона , кодирующих белки , 8, 9, 10, 11 , Кроме того, подмножество DIPGs выражает мутации в гене ACVR1, которые ранее не были сообщены в раке , но идентичные мутации найдены в врожденная детстве развития расстройства фибродисплазия 8, 9, 10, 11. Кроме того, первый пациент полученные клеточные культуры DIPG и ортотопической ксенотрансплантата модельс в настоящее время установлено , 1, 2, 12, 13, 14, а также мышиные модели , выработанные на основе прямой ксенотрансплантации опухолевых клеток в иммунодефицитных мышей для генерации серийных ксенотрансплантаты 3, 14, 15. Первоначальные усилия скрининга лекарственных препаратов с использованием этих моделей пациентов происхождения определили перспективные новые средства для клинического перевода 4, 14 и заложили основу для по меньшей мере одного клинического исследования (NCT02717455).
Эти первые шаги в направлении прогресса являются только началом, а также многочисленные пациента полученные образцы тканей и модели культуры будут необходимы для определения подтипа заболевания и разработать наиболее эффективные терапевтические стратегии. Генетически двигательERed модели мыши DIPG будет также содействовать проведению исследований, направленных на дальнейшее наше понимание болезни. Усилия, предпринятые для создания генетических моделей для DIPG будет оказывать основополагающих геномных исследований, описанных выше, но в настоящее время ограниченное число опций доступны. Одной из таких моделей, которая генерирует гистологически аналогичные высокосортных ствола мозга глиомы, использует вирусный RCAS / TV-система для привода PDGF-B гиперэкспрессия и Ink4a-ARF потери в нестин-позитивных клеток в задней черепной ямке у новорожденных мышей 5, 16. Другой подход предполагает обобщал несколько крупных DIPG-ассоциированных мутаций (мутации K27M гистона H3.3, потеря p53 и активация PDGFRA) в нервных клеток – предшественников , полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток, что достаточно для визуализации этих клеток онкогенными 6, 7, 17. Сочетание генетических методов и пациента-, вытекающейМодели-е изд позволит доклинических испытаний и дальнейшее развитие эффективных методов лечения.
Для решения проблем в DIPG исследований подробно описано выше, этот быстрый протокол аутопсии был разработан для создания пациента , полученных клеточных культур для расследования 8, 9, 10, 11, 12, 14. Протокол предназначен для защиты жизнеспособности ткани и максимизировать вероятность формирования прочных культур, несмотря на трудности, связанные с увеличенными интервалами посмертных и времени транспортировки. Когда успешно генерироваться эти DIPG культуры могут быть использованы в последующих манипуляций в пробирке и в естественных условиях экспериментов ксенотрансплантатных, что позволяет для оценки потенциальных терапевтических молекул на клетках пациента происхождения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описан способ быстрой обработки посмертных пожертвования опухолевой ткани для развития пациента , полученных клеточных культур, которые могут быть использованы в различных в пробирке или в экспериментах естественных условиях. Из-за характера работы с образцами аутопсии, поддержание жизнеспособности образца представляет собой значительную проблему. Несколько факторов, влияющих, в том числе интервал посмертном аутопсии или время, необходимое для транспортировки ткани, следует свести к минимуму, насколько это возможно, но часто трудно контролировать. По нашему опыту, посмертным интервалом менее 6 – 8 ч (от момента смерти до момента, что ткань помещают в лед холодной доставки и транспортировки средств массовой информации) дала наилучшие шансы установления прочного клеточной культуры. Лучше всего, чтобы затем получить ткани в лаборатории в течение 24 часов, и обрабатывать его для культуры сразу после получения.
Поскольку расположение этих редких случаев колеблется в широких пределах, икачество на этапе поиска информации ткани сильно влияет на шансы на успех, материально-техническое обеспечение выполнения вскрытие трупа может быть сложной задачей. Во многих случаях для достижения сроки 6-8 часа, это не представляется возможным провести урожай ткани в академическом центре. Вместо того, чтобы, имея в службу восстановления тканей по вызову для восстановления ткани опухоли в похоронном доме под IRB утвержденных протоколом часто является более целесообразным для восстановления тканей. Получение информированного согласия в преддверии смерти рекомендуется и облегчает материально-технического планирования. Подготовка комплектов аутопсии самодостаточные с четкими и подробные инструкции и стерильных принадлежностей для извлечения тканей (перчатки, портьеры, скальпели) настоятельно рекомендуется. Кроме того, установление четких точек связи между исследователем, патологоанатомом и похоронный дом имеет решающее значение. Например, исследователь должен обсудить протокол с патологоанатомом до вскрытия и выделить наиболее распространенные ошибки. Эти ошибки включают в себя микроЗагрязнение BIAL (как правило, дрожжи) во время извлечения ткани, неспособность корабль через ночной / ускорено судоходства и отказа отгружать образца на достаточном мокром льду в контейнере теплоизоляция. И, наконец, мы рекомендуем использовать от двери до двери курьерской службы для доставки образца, чтобы минимизировать время транспортировки.
Следует также принимать во время диссоциации ткани, чтобы сохранить жизнеспособность клеток. Например, использование средств массовой информации, направленных на сохранение здоровья нервной ткани для транспортировки (Hibernate-A с добавлением антибиотика / противогрибкового) увеличит вероятность формирования успешной культуры. Кроме того, важно, чтобы держать образец при низкой температуре в течение всего протокола, всегда передавая образцы на льду. Сбор как механические, так и ферментативные фракции диссоциации наряду с минимизации растирание может улучшить успех протокола, поскольку оба шага являются травматический к клеткам. По нашему опыту, в то время как большинство успешных культур растут из обеих фракций, Мы имели случаи, когда только один из двух препаратов, создала прочную культуру, потенциально отражающие нежную природу этих образцов. Еще один травматический шаг в протоколе является растирание; одна стратегия, которая может уменьшить степень растиранием необходимой является обеспечение образцы тщательно измельченная в самом начале подготовки. Другие примеры аспектов протокола , разработанных для повышения жизнеспособности образца включают в себя добавление буферов (например, HEPES) на протяжении всего протокола, который является особенно критично при ферментативном диссоциации.
Возможное изменение этого протокола для дальнейшего повышения жизнеспособности клеток является удаление красных кровяных телец стадии клеточного лизиса ACK. Тем не менее, в этом случае, часто бывает тогда необходимо выполнить шаг ACK для лизиса в течение начальной недели в культуре, чтобы удалить эритроциты. Другой аспект этого протокола, который может быть модифицирован является устранение миелина и клеточных остатков с использованием DENSIT сахарозыу градиента. В частности, другие стратегии , которые были зарегистрированы , чтобы улучшить жизнеспособность клеток микроглии клеток, также возможно на этом этапе, например, прерывистой Percoll градиент плотности 18 или магнитных шариков удаление миелина.
Наконец, длительность между начальной диссоциации ткани и появление нейросферах варьируется между образцами и может занять от недели до месяца и более. Так как начальные культуры, как правило, содержат значительную степень мертвых клеток и клеточных остатков, она может быть сложной задачей, чтобы определить, остается ли жизнеспособных клеток; культура должна поддерживаться в течение по крайней мере 4 – 8 недель (рисунок 2). Одна из стратегий для выделения клеток , растущих от остального мусора представлена здесь (т.е. обратной фильтрации клеточных кластеров и повторное покрытие в свежей среде). Решение о том, следует ли продолжать поддерживать культуру, в конечном счете решение от случая к случаю на основании факторов, окружающих тысе вскрытие трупа (например, длительный интервал посмертных, проблемы во время транспортировки ткани), диссоциация ткани (например, чрезмерная кровь или мусор), и как образец появляется в культуре. После того, как культура установлено, личность должна быть подтверждена с помощью ДНК-дактилоскопии с помощью краткого анализа тандемной дупликации или подобный метод, сравнивая культуру к образцу исходной опухоли сохраняется для этой цели. Мы рекомендуем регулярно проверки культур с помощью ДНК-дактилоскопии, чтобы гарантировать, что никакого загрязнения другими культурами не произошло, например, через каждые 3 – 6 месяцев.
Поколение этих пациентов происхождения DIPG культур представляет собой важный шаг в успешном развитии эффективных методов лечения. Расширение имеющихся моделей пациентов происхождения DIPG культуры и ксенотрансплантатных будет иметь решающее значение для определения наиболее эффективных терапевтических стратегий и в конечном счете преодолеть эту разрушительную болезнь.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность поддержку от McKenna Клэр фонда, Национального института неврологических расстройств и инсульта (NINDS K08NS070926 и R01NS092597), Министерства обороны (NF140075), Калифорнийский институт регенеративной медицины (CIRM RB4-06093 и RN3-06510), лимонад Алекса Stand Foundation, The Cure начинается сейчас Фонд и DIPG Collaborative, Lyla Nsouli Фонд Распутайте педиатрического рака, Фонд Опухоль мозга у детей, Мэтью Larson Фонд, V Фонд, Фонд Семья Годфри в память Фиона Пенелопы, в Wayland Виллар DIPG Фонда, Dylan Jewett Коннор Джонсон, Зои Ганеш, Дилан Фрик, Эбигейл Йенсен, и Дженнифер Кранц фонды, Меморандум n8 фонда, Вирджиния и Д. К. Людвига Фонд исследований рака, Научно-исследовательский институт здоровья ребенка при Стэнфордском Энн Т. и Роберт М. Басса наделенный факультета Стипендия в педиатрии Рак и крови Болезни.
Materials
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco | 24020-117 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Liberase DH (Collagenase/Dispase) | Roche | 5401054001 | |
| DNAse I | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| Neurobasal-A | Gibco | 10888-022 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| GlutaMAX-I (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| B27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Human PDGF-AA | Shenandoah Biotechnology | 100-16 | |
| Human PDGF-BB | Shenandoah Biotechnology | 100-18 | |
| Human EGF | Shenandoah Biotechnology | 100-26 | |
| Human FGF | Shenandoah Biotechnology | 100-146 | |
| Sterile scalpel blades | Bard Paker | 372610 | |
| Curved hemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| 100 x 20 mm cell culture dish | Corning | 353003 | |
| Sterile forceps | TWD Tradewinds | DF8988-5 | |
| Sterile drapes | 3M | 2037 | |
| Sterile gloves | Kimberly Clark | 1182307 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| 100 micron mesh filter | Fisher | 352360 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 1495949A |
References
- Fisher, P. G., et al. A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities. Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).
- Johung, T. B., Monje, M. Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic. Curr. Neuropharmacol. , (2016).
- Cage, T. A., et al. Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children. Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas. Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Kieran, M. W. Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).
- Sturm, D., et al. Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge. Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).
- Jones, C., Baker, S. J. Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma. Nat. Rev. Cancer. , (2014).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).
- Wu, G., et al. The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma. Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).
- Fontebasso, A. M., et al. Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma. Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).
- Buczkowicz, P., et al. Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating. Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).
- Monje, M., et al. Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).
- Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).
- Grasso, C. S., et al. Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Med. , 1-10 (2015).
- Shu, Q., et al. Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma. Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).
- Becher, O. J., et al. Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma. Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).
- Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation. Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
