Organotypic гиппокампа ломтик культур (страховой) представляют собой модель в пробирке , которая моделирует ситуацию в естественных условиях очень хорошо. Здесь мы описываем, основанных на vibratome улучшение нарезки протокол для получения фрагментов высокого качества для использования в оценке нейропротекторной потенциал новых веществ или биологическое поведение опухолевых клеток.
В культурах гиппокампа срез organotypic (ОАО) хорошо сохранились Морфологические и функциональные характеристики нейронов и глиальных клеток. Эта модель подходит для решения различных исследовательских вопросов, которые включают исследования по нейропротекции, электрофизиологические эксперименты на нейроны, нейронных сетей или прорастание опухоли. Гиппокампа архитектуры и активности нейронов в multisynaptic цепи хорошо сохраняется в страховой, хотя сама процедура нарезки первоначально поражений и приводит к формированию глиальный рубец. Формирование рубца изменяет предположительно механических свойств и диффузионного поведение малых молекул и др. Фрагменты позволяют контролировать время зависимых процессов после травм головного мозга без животных хирургия и исследования по вопросам взаимодействия между различными типами клеток мозга, полученных, а именно астроциты, Микроглия и нейронов под физиологических и патологических условий. Двойственные аспектом этой модели является отсутствие кровотока и иммунных клеток крови. При прогрессировании нейронных травмы перенос иммунные клетки из крови играют важную роль. Поскольку эти клетки отсутствуют в фрагменты, внутренние процессы в культуре может наблюдаться без внешнего вмешательства. Кроме того в страховой точно контролируется состав средне внешней среды. Еще одним преимуществом данного метода является меньшее количество жертвенных животных, по сравнению с стандартным препаратов. Несколько OHSC можно получить из одного животного, возможность одновременного исследования с несколько процедур в одном животном. По этим причинам страховой хорошо подходят для анализа воздействия новых защитных терапии после повреждения тканей или во время вторжения опухоли.
Протокол представил здесь описывается метод подготовки страховой, которая позволяет генерировать высокую воспроизводимость, хорошо сохранились фрагменты, которые могут быть использованы для целого ряда экспериментальных исследований, как нейропротекторного эффекта или опухоль вторжения исследования.
Страховой являются хорошо изученных в vitro модель для изучения физиологических и патологических свойства нейронов, астроциты и микроглии1. Это легко управлять средой внеклеточные и мониторинга сотовых и морфологические изменения после различные стимулы. Организация гиппокампа нейронов и их соединения хорошо сохранились после подготовки2,3. Из несколько преимуществ страховой позволяют контролировать вторжения травмы и опухоли головного мозга без животных хирургия. Шесть-восемь страховой можно получить от одного грызунов мозга. Страховой поэтому помочь существенно уменьшить количество животных и позволяют тестирования нескольких концентрации наркотиков, генетические манипуляции или различные поражения модели в то же самое животное. В основе ломтик анализов экспериментальных условиях может управляться точно. Кроме того время зависит от развития патологических состояний как вторичные убытки может легко контролироваться покадровой изображений.
В заданном протоколе, первоначально учрежденной Stoppini et al. 4подготовка шаги описываются и выделены морфологическая достопримечательности для отбора соответствующих фрагментов. Мы рекомендуем подготовку послеродовой 7-9 день крыс или мышей послеродовой день 4-5. В эти периоды страховой Показать надежный сопротивление механических травм и высокий потенциал для реорганизации нейронных цепей. В отличие от этого препараты от эмбриональных или взрослых крыс быстро изменить их структуру и теряют их морфология organotypic во время выращивания и поэтому меньше подходят для изучения долгосрочных процессов в фундаментальных исследований5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. Другой критической точкой для выживаемости страховой является толщина среза, сам, как диффузии и, таким образом, питательных являются ограниченные12,,1314.
Настоящий Протокол описывает подготовку страховой. Эта модель позволяет тестирование встроенных возможностей и реакции ткани головного мозга после применения физиологических и патологических стимулов. Помимо анализа электрофизиологические параметры страховой может быть пораженн?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Christine Auste за ее поддержку с видео-записи и Гадбан Chalid за его прекрасную техническую помощь. Urszula Grabiec было поддержано FKZ программа ру 29/18.
6-Well | Falcon | 35-3046 | |
Agar | Fluka | 5040 | |
Autoclav | Systec | DX-45 | |
CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 | Vector Labs | FL-1201 | |
Glucose | Merk | 1083371000 | |
Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
U138 | ATCC | HTB-14 | |
Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |