Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים
Summary
Organotypic פרוסה בהיפוקמפוס תרבויות (OHSC) מייצגים במבחנה דגם המדמה את המצב ויוו היטב. כאן נתאר מבוסס-vibratome משופרת עם פרוסות פרוטוקול כדי לקבל פרוסות באיכות גבוהה לשימוש בהערכת הפוטנציאל neuroprotective של חומרים חדשניים או ההתנהגות הביולוגית של תאים סרטניים.
Abstract
בתרבויות organotypic פרוסה בהיפוקמפוס (OHSC), המאפיינים פונקציונלי מורפולוגיים של שני נוירונים ותאי גלייה הם השתמרה היטב. מודל זה מתאים פונה שאלות מחקריות שונות הכרוכות מחקרים על neuroprotection, אלקטרופיזיולוגיות ניסויים הנוירונים, רשתות עצביים או גידול הפלישה. האדריכלות בהיפוקמפוס ואת פעילות. עצבית ב מעגלים multisynaptic הם טוב שמור ב OHSC, למרות הנוהל עם פרוסות עצמה בתחילה נגעים ומובילה היווצרות צלקת גליה. היווצרות צלקת משנה יש להניח את תכונות מכניות וההתנהגות דיפוזיה של מולקולות קטנות, וכו ‘. פרוסות לאפשר פיקוח על תהליכי תלויות זמן לאחר פגיעה מוחית ללא ניתוח בעלי חיים, וכן מחקרים על אינטראקציות בין סוגי תאים במוח-derived שונים, כלומר האסטרוציטים, מיקרוגלייה ו נוירונים תחת פיזיולוגיים ופתולוגיים תנאים. היבט אמביוולנטי של מודל זה הוא העדר זרימת דם ותאי דם חיסוניים. במהלך ההתקדמות של הפגיעה העצבית, העברת תאים חיסוניים מהמחזה דם תפקיד חשוב. כאשר תאים אלה חסרים לפרוסות, התהליכים מהותי בתרבות ייבחנו ללא הפרעה חיצונית. יתר על כן, ב- OHSC ההרכב של הסביבה בינוני-חוץ נשלטת בצורה מדויקת. יתרון נוסף של שיטה זו הוא המספר הנמוך יותר של חיות שהקריבה עצמה לעומת סוגי הפינויים הסטנדרטיים. ניתן להשיג את מספר OHSC מחיה לחיה ביצוע מחקרים בו זמנית עם מספר טיפולים אפשריים חיה אחת. מסיבות אלו, OHSC מתאימים היטב כדי לנתח את ההשפעות של הרפוי מגן חדש לאחר נזק לרקמות או במהלך הפלישה הגידול.
פרוטוקול שהוצג כאן מתאר שיטת הכנה OHSC המאפשרת יצירת מאוד לשחזור, ישמרו פרוסות יכול לשמש למגוון רחב של מחקר ניסיוני, כמו מחקרים הפלישה neuroprotection או גידול.
Introduction
OHSC הם מודל מאופיין היטב במבחנה ללמוד מאפיינים פיזיולוגיים ופתולוגיים של נוירונים, האסטרוציטים מיקרוגלייה1. קל יותר לשלוט בסביבה חוץ-תאית ולעקוב אחר השינויים הסלולר מורפולוגי אחרי גירויים שונים. הארגון של נוירונים בהיפוקמפוס והקשרים שלהם הם שנשתמרו לאחר הכנה2,3. מתוך מספר יתרונות, OHSC לאפשר פיקוח על הפלישה פציעה, גידול במוח ללא ניתוח בעלי חיים. 6-8 OHSC ניתן להשיג מוח מכרסמים יחיד. OHSC ולכן הם מסייעים באופן משמעותי להפחית את מספר בעלי החיים ולאפשר בדיקות סמים ריכוזים מרובים, שינויים גנטיים או מודלים שונים הנגע אותה חיה. במבחני המבוסס על פרוסה, תנאים ניסיוני יכול להיות דווקא נשלט. בנוסף, זמן פיתוח תלות של מצבים פתולוגיים כמו נזקים משניים יכול בקלות יהיה פיקוח על ידי הדמיה בצילום מואץ.
בפרוטוקול נתון, שנוסדה במקור על ידי Stoppini. et al. 4, ההכנה המתוארת, ציוני מורפולוגי החשובים לבחירת פרוסות המתאים מודגשים. אנו ממליצים על הכנת כמחנכת יום 7-9 חולדות או עכברים כמחנכת ביום 4-5. בתקופות אלה, OHSC מראים התנגדות חזקה טראומות מכני ובעל פוטנציאל גבוה רה-ארגון של מעגלים עצביים. לעומת זאת, גלמי חולדות עובריים או למבוגרים במהירות לשנות את המבנה שלהם מאבדים מורפולוגיה organotypic שלהם במהלך הטיפוח-תרגול ואת ולכן מתאימים פחות לימוד לטווח ארוך בתהליכי מחקר בסיסי5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. עוד נקודה קריטית עבור שיעור הישרדות של OHSC הוא עובי הפרוסה עצמה כמו דיפוזיה ובכך אספקת מזונם הם מוגבלים12,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול הנוכחי מתאר את הכנת OHSC. דגם זה מאפשר בדיקה של תגובות של רקמת המוח ויכולות מהותי לאחר היישום של גירויים פיזיולוגיים ופתולוגיים. מלבד ניתוחים של פרמטרים אלקטרופיזיולוגיות, OHSC יכול להיות lesioned, ההשפעות של נזק על כל סוגי תאים יכול להיקבע. טיפול עם חומרים שונים על תיאור מפורט של תהליכי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות כריסטין Auste לתמיכה שלה עם הקלטת וידאו, Chalid Ghadban לסיוע טכני מעולה שלו. אורסולה Grabiec נתמכה על ידי רו Programm FKZ 29/18.
Materials
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 | Vector Labs | FL-1201 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
References
- Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
- Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
- Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
- Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11 (11), 484-489 (1988).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
- Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
- Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. . New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , (2005).
- Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
- Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
- Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
- Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
- Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
- Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
- Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
- He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
- Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
- Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neuroscience. 208, 97-108 (2012).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
- Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neuroscience. 63 (2), (1994).
- Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
- Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
- Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
- Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
- Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ‘ unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
- Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).
