أورجانوتيبيك شريحة هيبوكامبال الثقافات كنموذج للدراسة نيوروبروتيكتيون واختزاع الخلايا السرطانية
Summary
وتمثل الثقافات شريحة هيبوكامبال أورجانوتيبيك (أوهسك) في المختبر نموذجي الذي يحاكي الوضع في فيفو جيد جداً. هنا نحن تصف المستندة إلى فيبرتوم تحسن تشريح البروتوكول للحصول على شرائح ذات جودة عالية للاستخدام في تقييم إمكانات محصن من مواد جديدة أو السلوك البيولوجي للخلايا السرطانية.
Abstract
في الثقافات شريحة هيبوكامبال أورجانوتيبيك (أوهسك) والخصائص المورفولوجية والوظيفية لكل من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية حفظت جيدا. هذا النموذج مناسبة لمعالجة المسائل البحثية المختلفة التي تشمل الدراسات المتعلقة نيوروبروتيكشن، التجارب الكهربية في الخلايا العصبية، الشبكات العصبية أو غزو الورم. هندسة هيبوكامبال ونشاط الخلايا العصبية في الدوائر مولتيسينابتيك بخير المصانة في أوهسك، حتى ولو إجراء تشريح نفسه في البداية الآفات ويؤدي إلى تشكيل ندبة الدبقية. تشكيل ندبة يغير يفترض أن الخصائص الميكانيكية والسلوك انتشارية من الجزيئات الصغيرة، إلخ. شرائح تسمح برصد العمليات يتوقف الوقت بعد إصابة في الدماغ دون جراحة الحيوان، والدراسات المتعلقة بالتفاعلات بين مختلف أنواع الخلايا المستمدة من الدماغ، إلا وهي أستروسيتيس و microglia والخلايا العصبية تحت الفسيولوجية والمرضية على حد سواء شروط. جانبا متناقضة في هذا النموذج هو عدم وجود تدفق الدم وخلايا الدم المناعية. أثناء تطور الإصابة العصبية، تهاجر الخلايا المناعية من الدم تلعب دوراً هاما. كما تلك الخلايا مفقودة في شرائح، يمكن ملاحظة عمليات المتأصلة في الثقافة دون تدخل خارجي. وعلاوة على ذلك، أن تكوين البيئة الخارجية المتوسطة يتم التحكم التحديد في أوهسك. وثمة ميزة أخرى لهذا الأسلوب هو انخفاض عدد الحيوانات يضحي بالمقارنة مع الإعداد القياسية. يمكن الحصول على أوهسك عدة من الحيوان واحدة مما يجعل الدراسات المتزامنة مع علاجات متعددة في الحيوان واحد ممكن. لهذه الأسباب، أوهسك مناسبة تماما لتحليل تأثيرات العلاجات الوقائية الجديدة بعد تلف الأنسجة أو أثناء غزو الورم.
بروتوكول قدم هنا وصف أسلوب إعداد من أوهسك التي تتيح توليد استنساخه بدرجة عالية، وكذلك الحفاظ على الشرائح التي يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من البحوث التجريبية، مثل دراسات غزو نيوروبروتيكشن أو الورم.
Introduction
أوهسك نموذجا جيدا تتسم في المختبر دراسة الخصائص الفسيولوجية والمرضية على حد سواء من الخلايا العصبية وأستروسيتيس وميكروجليا1. من السهل التحكم في بيئة خارج الخلية، ورصد التغيرات الخلوية والمورفولوجية بعد المحفزات المختلفة. منظمة هيبوكامبال الخلايا العصبية وصلاتهم يتم الحفاظ عليها جيدا بعد إعداد2،3. من مزايا عدة، السماح أوهسك برصد غزو الإصابات وورم الدماغ دون جراحة الحيوان. يمكن الحصول على أوهسك ستة إلى ثمانية من دماغ القوارض وحيدة. أوهسك وبالتالي يساعد على خفض عدد الحيوانات إلى حد كبير والسماح باختبار عدة تركيزات المخدرات أو التلاعبات الجينية أو نماذج مختلفة من الآفة في الحيوان نفسه. في فحوصات المستندة إلى شريحة، يمكن التحكم الظروف التجريبية بدقة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة رصد التنمية يتوقف الوقت للحالات المرضية مثل الأضرار الثانوية قبل الوقت الفاصل بين التصوير.
في بروتوكول معين، أنشأته أصلاً ستوبيني et al. 4خطوات التحضير موصوفة وهي أبرز معالم مورفولوجية هامة لاختيار الشرائح المناسبة. نوصي بإعداد الفئران بعد الولادة يوم 7-9 أو الفئران بعد الولادة يوم 4-5. في هذه الفترات، وإظهار أوهسك بمقاومة قوية للصدمات الميكانيكية وقدرة عالية على إعادة تنظيم الدوائر العصبية. وفي المقابل، الاستعدادات من الفئران الجنينية أو الكبار سرعة تغيير بنيتها وتفقد مورفولوجيا أورجانوتيبيك بهم أثناء زراعة وبالتالي فهي أقل ملاءمة لدراسة العمليات الطويلة الأجل في البحوث الأساسية5،6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11-آخر نقطة حرجة لأن معدل البقاء على قيد الحياة من أوهسك هو سمك الشريحة نفسها كما نشر وهكذا إمدادات المواد الغذائية المحدودة12،،من1314.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول إعداد أوهسك. هذا النموذج يسمح لاختبار القدرات الذاتية وردود الفعل من أنسجة المخ بعد تطبيق المحفزات الفسيولوجية والمرضية. بالإضافة إلى تحليلات لمعلمات الكهربية، يمكن أن يكون أوهسك ليسيونيد ويمكن تحديد آثار الضرر في جميع أنواع الخلايا. من الممكن للعلاج بالمواد المختلف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر أستي كريستين تأييدها مع تسجيل الفيديو وغضبان شليد لمساعدته التقنية الممتازة. وأيد جرابيك Urszula فكز البرنامج رو 29/18.
Materials
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 | Vector Labs | FL-1201 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
References
- Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
- Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
- Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
- Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11 (11), 484-489 (1988).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
- Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
- Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. . New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , (2005).
- Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
- Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
- Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
- Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
- Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
- Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
- Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
- He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
- Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
- Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neuroscience. 208, 97-108 (2012).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
- Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neuroscience. 63 (2), (1994).
- Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
- Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
- Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
- Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
- Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ‘ unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
- Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).
