Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen
Summary
Organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind eine in-vitro- Modell, die die in-Vivo -Situation sehr gut simuliert. Hier beschreiben wir eine Vibratome-basierte verbessert schneiden-Protokoll, um qualitativ hochwertige Scheiben für den Einsatz bei der Beurteilung der neuroprotektive Potenzial der neuartigen Substanzen oder das biologische Verhalten der Tumorzellen zu erhalten.
Abstract
Im organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind die morphologischen und funktionellen Eigenschaften der Neuronen und Gliazellen gut erhalten. Dieses Modell eignet sich für den Umgang mit verschiedenen Forschungsfragen, die Studien zur Neuroprotektion, Elektrophysiologische Experimente auf Neuronen, neuronale Netze oder Tumorinvasion beinhalten. Der Hippokampus Architektur und neuronaler Aktivität in multisynaptic Schaltungen sind gut konserviert in OHSC, obwohl das slicing Verfahren selbst zunächst Läsionen und führt zur Bildung einer glial Narbe. Die Narbenbildung ändert vermutlich die mechanischen Eigenschaften und diffusiven Verhalten von kleinen Molekülen, etc.. Scheiben erlauben die Überwachung der Zeit abhängigen Prozesse nach Hirnverletzung ohne tierische Chirurgie und Studien zu Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Gehirn abgeleitet Zelltypen, nämlich Astrozyten, Mikroglia und Neuronen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Ein ambivalenter Aspekt dieses Modells ist das Fehlen von Blutfluss und Immunzellen im Blut. Während der Progression der neuronalen Verletzung Migration Immunzellen aus Blut spielen eine wichtige Rolle. Da diese Zellen in Scheiben fehlen, können die innere Prozesse in der Kultur ohne Einmischung von außen beobachtet werden. Darüber hinaus ist die Zusammensetzung der Medium-externe Umwelt in OHSC exakt gesteuert. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die geringere Anzahl der geopferten Tiere im Vergleich zu standard-Vorbereitungen. Mehreren OHSC erhalten Sie von einem Tier ermöglichen die gleichzeitige Studien mit mehreren Behandlungen in einem Tier. Aus diesen Gründen OHSC sind gut geeignet, um die Auswirkungen der neuen schützenden Therapeutika nach Gewebeschädigung oder während Tumorinvasion analysieren.
Das Protokoll präsentiert hier beschreibt eine Vorbereitung Methode der OHSC, die Erzeugung von hoch reproduzierbare ermöglicht, gut erhaltene Scheiben, die für eine Vielzahl von experimentellen Untersuchungen, wie z.B. Neuroprotektion oder Tumor Invasion Studien verwendet werden können.
Introduction
OHSC sind eine gut charakterisierte in Vitro Modell zur physiologische und pathologische Eigenschaften der Neuronen, Astrozyten und Mikroglia1. Es ist einfach die extrazelluläre Umwelt steuert und überwacht die zellulären und morphologische Veränderungen nach verschiedene Reize. Die Organisation der hippocampal Neuronen und ihre Verbindungen sind nach Vorbereitung2,3gut erhalten. Aus mehrere Vorteile OHSC ermöglichen eine Überwachung der Gehirn Verletzungen und Tumor Invasion ohne tierische Operation. Sechs bis acht OHSC erhalten Sie bei einem einzigen Nagetier Gehirn. OHSC daher deutlich reduzieren die Anzahl der Tiere und ermöglichen testen mehrere Drogen Konzentrationen, genetische Manipulationen oder verschiedene Läsion Modelle im gleichen Tier helfen. Im Slice-based Assays können experimentelle Bedingungen exakt gesteuert werden. Darüber hinaus Zeit abhängige Entwicklung von pathologischen Zuständen wie Folgeschäden durch Time-Lapse-Bildgebung leicht überwacht werden können.
In das angegebene Protokoll, ursprünglich festgelegten Stoppini Et al. 4, die Vorbereitungsschritte sind beschrieben und wichtige morphologische Wahrzeichen für die Auswahl der entsprechenden Scheiben werden hervorgehoben. Es wird empfohlen, die Vorbereitung der postnatalen Tag 7-9 Ratten oder postnatale Tag 4-5 Mäuse. In diesen Perioden OHSC zeigen eine robuste Beständigkeit gegen mechanische Verletzungen und ein hohes Potential für die Reorganisation von neuronalen Schaltkreisen. Im Gegensatz dazu Zubereitungen aus embryonalen oder erwachsenen Ratten schnell ändern ihre Struktur verlieren ihre organotypischen Morphologie während des Anbaus und eignen sich daher weniger für das Studium langfristige Prozesse in Grundlagenforschung5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. ein weiterer kritischer Punkt für die Überlebensrate der OHSC ist die Dicke der Scheibe selbst, da die Diffusion und damit Nährstoffversorgung begrenzte12,13,14 sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung der OHSC. Dieses Modell ermöglicht die Prüfung der inneren Fähigkeiten und Reaktionen von Hirngewebe nach der Anwendung der physiologischen und pathologischen Reize. Neben Analysen elektrophysiologische Parameter kann OHSC lesioned und die Auswirkungen eines Schadens auf alle Zelltypen ermittelt werden. Behandlung mit verschiedenen Substanzen und die detaillierte Beschreibung der schädigendes Prozesse oder in Ermangelung von Makrophagen und Lymphozyten Heilung ist möglich…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Christine Auste für ihre Unterstützung mit der video-Aufzeichnung und Chalid Ghadban für seine hervorragenden technischen Betreuung danken. Urszula Grabiec stützten die Roux Programm FKZ 29/18.
Materials
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 | Vector Labs | FL-1201 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
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