Summary

Hippocampe organotypiques comme modèle d’étude Neuroprotection et son caractère invasif des cellules tumorales

Published: August 27, 2017
doi:

Summary

Hippocampe organotypiques (CSST) représentent un modèle in vitro qui simule la situation in vivo très bien. Nous décrivons ici une base vibratome amélioré tranchage protocole pour obtenir des tranches de haute qualité devant servir à évaluer le potentiel neuroprotecteur de substances nouvelles ou le comportement biologique des cellules tumorales.

Abstract

Dans l’hippocampe organotypiques (CSST), les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des neurones et de cellules gliales sont bien conservés. Ce modèle est adapté pour répondre aux questions de recherche différentes qui impliquent des études sur la neuroprotection, expériences électrophysiologiques sur les neurones, les réseaux neuronaux ou invasion tumorale. L’architecture de l’hippocampe et l’activité neuronale dans les circuits de multisynaptic sont bien conservées dans CSST, même si la procédure de trancher elle-même initialement des lésions et conduit à la formation d’une cicatrice gliale. La formation de cicatrices modifie sans doute les propriétés mécaniques et le comportement de diffusion de petites molécules, etc.. Tranches de permettent le suivi des processus dépendants du temps après traumatisme crânien sans chirurgie animale et les études sur les interactions entre les divers types de cellules encéphales, nommément astrocytes, la microglie et les neurones sous tant physiologiques que pathologiques conditions. Un aspect ambivalent de ce modèle est l’absence de flux sanguin et immunitaire des cellules sanguines. Au cours de la progression de la lésion neuronale, la migration des cellules immunitaires d’après la pièce de sang un rôle important. Comme ces cellules manquent en tranches, on peuvent observer les processus intrinsèques dans la culture sans ingérence extérieure. En outre, à la CSST la composition de l’environnement du milieu extérieur est contrôlée avec précision. Un autre avantage de cette méthode est la diminution du nombre d’animaux sacrifiés par rapport aux préparations standards. Plusieurs CSST peut provenir d’un animal permettant des études simultanées avec des traitements multiples chez un animal. Pour ces raisons, la CSST sont bien adaptés pour analyser les effets de nouvelles thérapeutiques de protection après des lésions tissulaires ou au cours de l’invasion tumorale.

Le protocole présenté ici décrit une méthode de préparation de la CSST qui permet de générer très reproductible, bien conservé les tranches qui peuvent être utilisés pour une variété de recherches expérimentales, comme études invasion neuroprotection ou une tumeur.

Introduction

CSST sont un modèle bien caractérisés in vitro pour étudier les propriétés physiologiques et pathologiques des neurones, les astrocytes et les cellules microgliales1. Il est facile de contrôler l’environnement extracellulaire et de surveiller les changements morphologiques et cellulaires après divers stimuli. L’Organisation des neurones de l’hippocampe et leurs connexions sont bien conservées après préparation2,3. De plusieurs avantages, CSST permettent la surveillance de l’invasion de lésions et tumeurs cérébrales sans chirurgie animale. Six à huit CSST peut être obtenues d’un seul cerveau de rongeur. CSST contribue ainsi à considérablement réduire le nombre d’animaux et permettent de tester plusieurs concentrations du médicament, des manipulations génétiques ou modèles de lésion différents chez le même animal. Dans les essais axés sur la tranche, conditions expérimentales peuvent être contrôlées avec précision. En outre, temps de développement dépendant d’états pathologiques comme dommages secondaires peuvent facilement être surveillés par imagerie de Time-lapse.

Dans le protocole donné, initialement créé par Stoppini et al. 4, les étapes de préparation sont décrites et morphologiques marquants pour la sélection des tranches appropriées sont mises en évidence. Nous vous recommandons la préparation des jours après la naissance, 7-9 rats ou des souris postnatal jour 4-5. Dans ces périodes, la CSST montrent une solide résistance aux traumatismes mécaniques et un potentiel élevé pour la réorganisation des circuits neuronaux. En revanche, préparations des rats adultes ou embryonnaires rapidement modifient leur structure et perdent leur morphologie organotypique pendant la culture et sont donc moins adaptées pour l’étude des processus à long terme dans la recherche fondamentale5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. un autre point critique pour la survie de la CSST est l’épaisseur de la tranche lui-même comme la diffusion et donc l’apport en nutriments sont limitées12,13,14.

Protocol

des expérimentations animales ont été effectuées conformément à la politique d’éthique et de la politique sur l’utilisation des animaux dans la recherche en neurosciences, tel qu’approuvé par l’européen collectivités Conseil Directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil de l’Union européenne sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. 1. préparation des Instruments et des milieux de Culture pour la préparation de la CSST, ut…

Representative Results

Études de Neuroprotection : Pour déterminer les dommages neuronaux, le nombre de noyaux positifs PI et IB4 positif la microglie dans chaque troisième section optique de la couche de cellules de granules (GCL) du gyrus denté (DG) a été comptée. Pour des expériences d’invasion tumorale, la z-projection d’intensité maximale de la pile a été utilisée pour calculer la superficie couverte par les cellules tumorales, en guise d’invasion et de visual…

Discussion

Le présent protocole décrit la préparation de la CSST. Ce modèle permet de tester les capacités intrinsèques et les réactions du tissu cérébral après l’application de stimuli physiologiques et pathologiques. En plus des analyses des paramètres électrophysiologiques, CSST peut être lésé, et les effets de dégâts sur tous les types de cellules peuvent être déterminés. Traitement avec différentes matières, la description détaillée des procédés de lésion ou de guérison en l’absence des macropha…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs aimeraient remercier Christine Auste pour son soutien avec l’enregistrement vidéo et Chalid Ghadban pour son excellente assistance technique. Urszula Grabiec était soutenue par le Roux Programm FKZ 29/18.

Materials

6-Well Falcon 35-3046
Agar Fluka 5040
Autoclav Systec DX-45
CFDA  Thermo Fisher V12883
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 Carl Zeiss
Eagle´s Minimal Essential Medium  Invitrogen 32360-034
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Labs FL-1101
Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 Vector Labs FL-1201  
Glucose Merk 1083371000
Glutamin Invitrogen 25030-024
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) Invitrogen 24020-133
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+  and Mg2+) Invitrogen 14170-138
Insulin Sigma Aldrich I5500
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A5960
L-Glutamin Invitrogen 25030-024
LN229 Cell-Lines-Service 300363
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) B.Braun 1050052
Millicell Culture Inserts Millipore PICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich M3262
Normal Horse Seum Invitrogen 26050-088
Penicillin Streptomycin Invitrogen 15140-122
Petri dishes (all sizes) Greiner 627160/664160/628160
PFA Roth 0335.1 toxic
Propidium iodid (PI) Sigma Aldrich 81845-25MG toxic
U138 ATCC HTB-14
Vibratome Leica Leica VT 1200

References

  1. Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
  2. Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
  3. Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  5. Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
  6. Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
  7. Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
  8. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11 (11), 484-489 (1988).
  9. Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
  10. Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
  11. Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
  12. Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
  13. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
  14. Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
  15. De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
  16. Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. . New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , (2005).
  17. Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
  18. Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
  19. Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
  20. Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
  21. Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
  22. Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
  23. Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
  24. Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
  25. Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
  26. Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
  27. Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
  28. Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
  29. He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
  30. Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
  31. Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neuroscience. 208, 97-108 (2012).
  32. Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
  33. Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neuroscience. 63 (2), (1994).
  34. Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
  35. Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
  36. Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
  37. Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
  38. Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
  39. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
  40. Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ‘ unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
  41. Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).

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Cite This Article
Grabiec, U., Hohmann, T., Hammer, N., Dehghani, F. Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (126), e55359, doi:10.3791/55359 (2017).

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