Culturas de rebanada Hippocampal Organotypic como un modelo para estudio neuroprotección e invasividad de las células tumorales
Summary
Las culturas Organotypic rebanada hippocampal (OHSC) representan un modelo en vitro que simula muy bien la situación en vivo . Aquí describimos un vibratome base mejorado rebanar protocolo para obtener rodajas de alta calidad para uso en la evaluación del potencial neuroprotector de nuevas sustancias o el comportamiento biológico de las células tumorales.
Abstract
En culturas de rebanada hippocampal organotypic (OHSC), las características morfológicas y funcionales de neuronas y células gliales están bien conservadas. Este modelo es adecuado para abordar cuestiones de investigación que involucran estudios de neuroprotección, experimentos electrofisiológicos de neuronas, redes neuronales o invasión del tumor. La arquitectura hippocampal y la actividad neuronal en circuitos multisynaptic están bien conservados en OHSC, aunque el procedimiento de corte inicialmente lesiones y conduce a la formación de una cicatriz glial. La formación de la cicatriz presumiblemente altera las propiedades mecánicas y comportamiento difusivo de moléculas pequeñas, etcetera. Láminas permiten el monitoreo de procesos dependientes del tiempo después de la lesión cerebral sin cirugía animal y los estudios sobre las interacciones entre los diversos tipos de células cerebrales, es decir, astrocitos, microglía y neuronas en fisiológicas y patológicas condiciones. Un aspecto ambivalente de este modelo es la ausencia de flujo sanguíneo y las células inmunes de la sangre. Durante la progresión de la lesión neuronal, migración de células inmunes del juego un papel importante de la sangre. Como esas células faltan en rodajas, se pueden observar los procesos intrínsecos de la cultura sin interferencia externa. Por otra parte, en OHSC la composición del ambiente externo medio es precisamente controlada. Otra ventaja de este método es el menor número de animales sacrificados en comparación con las preparaciones estándar. Varios OHSC puede obtenerse de un animal, posibilitando estudios simultáneos con múltiples tratamientos en un animal. Por estas razones, OHSC son muy adecuadas para analizar los efectos de la nueva terapéutica protectora después de daño de tejido o invasión del tumor.
El protocolo presentado aquí se describe un método de preparación de OHSC que permite generar altamente reproducible, bien conservado láminas que pueden utilizarse para una variedad de investigaciones experimentales, como estudios de neuroprotección o tumor invasión.
Introduction
OHSC son un modelo bien caracterizado en vitro para el estudio de propiedades fisiológicas y patológicas de las neuronas, astrocitos y microglia1. Es fácil de controlar el ambiente extracelular y los cambios morfológicos y celulares después de varios estímulos. La organización de las neuronas de hipocampales y sus conexiones están bien conservadas después de preparación2,3. De varias ventajas, OHSC permiten monitoreo de invasión de la lesión y tumor del cerebro sin cirugía animal. Seis a ocho OHSC puede obtenerse de un solo cerebro de roedor. OHSC por lo tanto ayudar a significativamente a reducir el número de animales y realizar las pruebas de varias concentraciones de la droga, manipulación genética o lesión diferentes modelos en el mismo animal. En rebanada-ensayos, condiciones experimentales pueden ser precisamente controladas. Además, tiempo de desarrollo dependiente de condiciones patológicas como daños secundarios puede controlarse fácilmente por proyección de imagen de Time-lapse.
En el protocolo dado, establecido originalmente por Stoppini et al. 4, los pasos de preparación se describe y se destacan importantes hitos morfológicos para la selección de láminas adecuadas. Se recomienda la preparación del día postnatal 7-9 ratas o ratones de día postnatal 4-5. En estos períodos, OHSC muestran una sólida resistencia a traumas mecánicos y un alto potencial para la reorganización de los circuitos neuronales. Por el contrario, preparaciones de ratas adultas o embrionarias rápidamente cambian su estructura y pierden su morfología organotypic durante el cultivo y por lo tanto son menos convenientes para el estudio de procesos a largo plazo en investigación básica5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. otro punto crítico para la tasa de supervivencia de OHSC es el espesor de la rebanada de sí mismo como la difusión y suministro de nutrientes es limitada12,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente Protocolo describe la preparación de OHSC. Este modelo permite realizar pruebas de capacidades intrínsecas y las reacciones de tejido cerebral después de la aplicación de estímulos fisiológicos y patológicos. Además de los análisis de los parámetros electrofisiológicos, OHSC puede ser lesionado y pueden determinar los efectos del daño en todos los tipos de la célula. Es posible el tratamiento con diferentes sustancias y la descripción detallada de procesos de lesiones o sanación en ausencia de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Christine Auste por su apoyo con la grabación de vídeo y Chalid Ghadban por su excelente asistencia técnica. Urszula Grabiec fue apoyado por el Roux Programm FKZ 29/18.
Materials
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 | Vector Labs | FL-1201 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
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