Karaciğer yaralanmaları heterojen bir hücre popülasyonunu temsil progenitör hücre genişlemesi eşlik ediyor. Bu hücresel bölmenin yeni sınıflandırma birden altgruplarının ayırmada sağlar. Burada tarif edilen yöntem, analiz ve başka analizler için de kullanılabilen çeşitli alt-kümelerinin yüksek saflıkta izole sitometri akışı göstermektedir.
Kronik karaciğer yaralanmaları sırasında, progenitör hücreler aynı zamanda inflamatuar hücre infiltrasyonu ve epitel hücre aktivasyonu görünümünü gerektirir kanalsal reaksiyon denilen bir süreçle, genişletmek. enflamatuar reaksiyonlar sırasında projenitör hücre popülasyonu çok histolojik analiz ile veya akış sitometri tabanlı teknikler ile, ya tek bir yüzey belirteçleri kullanılarak araştırılmıştır. Ancak, yeni yüzey belirteçleri karaciğer atası içinde çeşitli fonksiyonel olarak farklı alt kümeleri tespit / hücre bölmesini kaynaklanıyor. Burada sunulan yöntem, yalıtım ve yeni yüzey işaretleyici kombinasyonlarını kullanarak progenitör alt kümelerinin sitometri analizi ayrıntılı akışını açıklar. Ayrıca, çeşitli progenitör hücre alt yüksek saflıkta manyetik otomatik kullanılarak ve FACS ayıklama bazlı yöntemler ile izole edilebilir gösterilmiştir. Önemlisi, karaciğer roman ve basitleştirilmiş enzimatik ayrılma yüksek canlılığı bu nadir bir hücre popülasyonlarının izolasyonu sağlardiğer mevcut yöntemlere kıyasla üstündür. Bu da, in vitro projenitör hücreleri incelemek için ya da gen tanımlama profili analiz yüksek kaliteli RNA izole edilmesi için özellikle uygundur.
Karaciğer yenilenmesi çok hepatosit kendini yenileme kapasitesi ile ilişkilidir. Bununla birlikte, kronik karaciğer yaralanması ve hepatositlerin cholangiocytes, 1, 2, 3, 4 ayırt etme kabiliyetleri ile ilişkilendirilmiştir progenitör hücre aktivasyonu ve genişleme ile meydana gelir. Kronik yaralanma sırasında hepatosit proliferasyonu etkili değildir, çünkü bu özellikle geçerlidir. Progenitör hücreleri hedef alan çok sayıda genetik izleme çalışmalara rağmen, karaciğer rejenerasyonu rolleri 5, 6, 7, 8 tartışmalıdır. Ayrıca, progenitör hücrelerin aktivasyon yaralanmalarında 9 sırasında tam rolü hakkında sorular ortaya çıkarmaktadır karaciğerde artan fibrotik yanıtı, bağlantılı olmuştur10.
Progenitör hücre bölmesine heterojen doğası uzun mikrodiseksiyon veya hücre sıralama tabanlı yöntemler 1, 11 ile tek bir yüzey işaretleyici ifade eden progenitör hücreler izole edilmiş gen ekspresyon çalışmaları ile öne sürülmüştür. Gerçekten de, en son, yeni bir yüzey markör kombinasyonu kullanılarak gp38 (podoplanin) açık bir şekilde, çeşitli alt-12 progenitör hücrelerin önceki tek belirteçleri bağlandı. Önemlisi, bu alt-gruplar sadece yüzey işaretleyici ifadesinde farklılık değil, aynı zamanda yaralanmaların 12 sırasında işlevsel değişiklikler sergilemiştir.
Çoklu hayvan modelleri progenitör hücre aktivasyonu ve karaciğer rejenerasyonu araştırmak için kullanılmıştır. Çeşitli yaralanma türleri progenitör hücrelerin 12 alt kümelerini farklı aktivasyonunu teşvik gibi görünüyor. Bu ph açıklayabilirİnsanlarda 4 gözlenen kanalsal reaksiyon enotypic sapma. Böylece, progenitör hücrelerin karmaşık fenotipik ve fonksiyonel analizleri kendi yaralanmalarda rolü ve karaciğer hastalıklarında kanalsal reaksiyonun gerçek önemini anlamak için çok önemlidir.
Yüzey işaretleyici kombinasyonları yanı sıra, hücre izolasyonu protokolleri önemli farklılıklar daha önceki çalışmalarda 2 dayanarak sonuçları zorlaştırıyor. Bazı çalışmalar, önemli miktarda büyük ölçüde izole protokolünde farklıdır progenitör hücreler (örneğin, karaciğer ayrılma (enzim kombinasyonu ve işlemin süresi), yoğunluk, orta ve santrifüj hızı) rolünü ele 2. Optimize edilmiş izolasyon tekniği, nadir hücre popülasyonlarının daha iyi canlılığı sağlayan ve alt küme bileşiminin yansıtıcı, gelişmiş ve son zamanlarda 12 yayımlanmıştır. Bu makalenin amacı, bir daha det sağlamaktırBu karaciğer hücre izolasyon prosedürü ve alt küme analizi ailed protokol tekniğinin uygun üreme için izin vermek. Ayrıca, protokol yeni protokole göre farklılıklar göstermek için önceki izolasyon yöntemi ile bir karşılaştırmasını içerir.
Karaciğer iltihabı, farklı kökenlerden gelen hasarı progenitör hücre genişlemesi ve aktivasyon 2, 3 ile birlikte karaciğerdeki yenilenme sürecini tetikler. Bu karaciğer progenitör hücrelerin hücre özelliklerini kök sahip ve büyük olasılıkla çeşitli karaciğer hastalıklarının mekanizmasında önemli bir rol oynamaktadır.
Karaciğer progenitör hücrelerin heterojenliği uzun önerilmiştir. Farklı yüzey bel…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma VLK Alexander von Humboldt Vakfı Sofja Kovalevskaja Ödülü ile desteklenmiştir.
RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1 % stock solution |
10 % BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice |
Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1400, marks progenior cells |
Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1400 |
CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µl, marks progenitor cells |
CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µl |
Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |