Summary

Isolamento e Enriquecimento de fígado progenitoras Subconjuntos identificado por um marcador combinação de superfícies Novel

Published: February 18, 2017
doi:

Summary

lesões no figado são acompanhadas por expansão de células progenitoras que representa uma população celular heterogénea. classificação Novel deste compartimento celular permite a distinção dos vários subgrupos. O método descrito aqui ilustra a análise de citometria de fluxo e de alta pureza isolamento de vários subconjuntos que podem ser utilizadas para ensaios posteriores.

Abstract

Durante a lesões crónicas do fígado, células progenitoras expandir num processo chamado de reacção ductular, o que também implica o aparecimento de infiltrado celular inflamatório e a activação da célula epitelial. A população de células progenitoras durante essas reações inflamatórias tem sido principalmente investigado utilizando marcadores de superfície individuais, quer por análise histológica, ou por fluxo de técnicas baseadas em citometria. No entanto, os novos marcadores de superfície identificados vários subconjuntos funcionalmente distintas dentro do progenitor fígado / haste compartimento da célula. O método aqui apresentado descreve o isolamento e análise de citometria de fluxo detalhado de subconjuntos progenitoras usando combinações novo marcador de superfície. Além disso, demonstra como os vários subconjuntos de células progenitoras pode ser isolado com pureza elevada utilizando métodos automatizados magnética e separação por FACS com base em. Importante, novos e enzimática simplificado dissociação do fígado permite o isolamento destas populações de células raras com uma alta viabilidadeque é superior em comparação com outros métodos existentes. Isto é especialmente relevante para o estudo de mais células progenitoras in vitro ou para o isolamento de ARN de alta qualidade para analisar o perfil de expressão do gene.

Introduction

A regeneração hepática é geralmente associada com a capacidade de auto-renovação de hepatócitos. No entanto, as lesões crónicas do fígado ocorrem com a activação de células progenitoras e de expansão, que têm sido associadas com a sua capacidade de se diferenciar em hepatócitos e cholangiocytes 1, 2, 3, 4. Isto é especialmente relevante porque, durante a lesões crónicas, a proliferação de hepatócitos não é eficaz. Apesar de vários estudos de rastreamento genético visando células progenitoras, o seu papel na regeneração hepática permanece controverso 5, 6, 7, 8. Além disso, a activação de células progenitoras tem sido associada ao aumento da resposta fibrótica no fígado, o que levanta dúvidas sobre a sua função exacta durante 9 lesões, 10.

A heterogeneidade do compartimento de células progenitoras tem sido sugerido por estudos de expressão gênica que isolaram células progenitoras expressam um único marcador de superfície usando microdissection ou célula métodos baseados em triagem 1, 11. De fato, recentemente, uma combinação marcador de superfície utilizando gp38 novel (podoplanina) inequivocamente marcadores individuais anteriores de células progenitoras para vários subconjuntos 12. É importante ressaltar que esses subgrupos não só diferem na sua expressão do marcador da superfície, mas também exibiram alterações funcionais durante a lesões 12.

Vários modelos animais têm sido utilizados para investigar a activação de células progenitoras e a regeneração do fígado. Parece que os vários tipos de lesões promover a activação de diferentes subconjuntos de células progenitoras 12. Isto pode explicar o pHdivergência enotypic da reacção ductular observada em seres humanos 4. Assim, os fenotípicas e funcionais análises complexas de células progenitoras são fundamentais para compreender o seu papel na lesões e o verdadeiro significado da reação ductular em doenças do fígado.

Além combinações de marcadores de superfície, as diferenças cruciais em protocolos de isolamento de células complicar ainda mais as conclusões baseadas em estudos anteriores 2. Uma quantidade substancial de estudos abordaram o papel das células progenitoras que diferem muito em sua protocolo de isolamento (por exemplo, a dissociação do fígado (combinação de enzimas e duração do processo), de média densidade e velocidade de centrifugação) 2. Uma técnica de isolamento otimizado, proporcionando uma melhor viabilidade para populações de células raras e reflexiva da composição subconjunto, foi desenvolvido e publicado recentemente 12. O objetivo deste artigo é fornecer uma forma mais detProtocolo ailed deste procedimento de isolamento de células do fígado e o subconjunto de análise para permitir a reprodução apropriada da técnica. Além disso, o protocolo inclui uma comparação com o método de isolamento anterior para demonstrar as diferenças em comparação com o novo protocolo.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram realizados com a aprovação dos Comitês de Ética e de cuidados de animais da Universidade de Homburg Medical Center. 1. Preparação de Materiais e buffers Recém preparar todos os buffers necessários para a digestão do fígado utilizando componentes estéreis e uma capa laminar para evitar a contaminação bacteriana. Preparar o tampão de recolha (CB) através da mistura de 49,5 mL de meio RPMI e 0,5 mL de soro bovino fet…

Representative Results

O procedimento aqui apresentado para a digestão do fígado utilizando uma nova mistura de enzimas resulta numa suspensão de uma única célula contendo parenquimatosa do fígado e células não-parenquimatosas (Figuras 1 e 2a). Após a lise ACK-de células vermelhas do sangue, o fluxo directo análise de citometria da suspensão de célula única é possível (Figuras 1 e 2). A estratégia envolve a propagação de exc…

Discussion

Inflamação do fígado e lesões de diferentes origens desencadear processos regenerativos no fígado que são acompanhados pela expansão de células progenitoras e ativação 2, 3. Estas células progenitoras do fígado possuem características de células-tronco e provavelmente desempenham um papel importante no mecanismo patológico de várias doenças do fígado.

A heterogeneidade das células progenitoras do fígado tem sido s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Alexander von Humboldt Foundation Award Sofja Kovalevskaja a VLK.

Materials

RPMI Life Technologies 21875-034
phenol red free DMEM Life Technologies 31053-028
FBS Life Technologies 10270-106
Collagenase P Sigma-Aldrich 11249002001
DNAse-I Sigma-Aldrich 10104159001
Dispase Life Technologies 17105041
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01
HBSS Life Technologies 14025-050
PBS Sigma-Aldrich D8537
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002 Prepare 1 % stock solution
10 % BSA Miltenyi Biotec 130-091-376
autoMACS Rinsing Solution Miltenyi Biotec 130-091-222 add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice
Phenol-red free DMEM Sigma-Aldrich D1145
counting Beads Count Bright Life Technologies C36950
PI Miltenyi Biotec 130-093-233
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec 130-092-575
anti-CD31 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-097-418
anti-CD45 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-301
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485
CD64 Purified BioLegend 139302 Dilution: 1:100
CD16/32 Purified BioLegend 101302 Dilution: 1:100
CD45 APC/Cy7 BioLegend 103116 Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells
CD31 Biotin BioLegend 102504 Dilution: 1:200, marks endothelial cells
ASGPR1 Purified Bio-Techne AF2755-SP Dilution: 1:100, marks hepatocytes
Podoplanin APC BioLegend 127410 Dilution: 1:1400, marks progenior cells
Podoplanin Biotin BioLegend 127404 Dilution: 1:1400
CD133 PE Miltenyi Biotec 130-102-210 use 3 µl, marks progenitor cells
CD133 Biotin BioLegend 141206 Dilution: 1:100
CD34 Biotin eBioScience 13-0341-81 Dilution: 1:100
CD90.2 Pacific Blue BioLegend 140306 Dilution: 1:800
CD157 PE BioLegend 140203 Dilution: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421 BioLegend 118225 Dilution: 1:100
Sca-1 Biotin Miltenyi Biotec 130-101-885 use 10 µl
Mouse IgG2b, κ PE BioLegend 400311
Rat IgG1 PE BioLegend 400407
Rat IgG2b, κ APC/Cy7 BioLegend 400624
Rat IgG2a, κ Biotin BioLegend 400504
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 BioLegend 400535
Syrian Hamster IgG APC BioLegend 402012
Syrian Hamster IgG Biotin BioLegend 402004
Normal Goat IgG Control Purified Bio-Techne AB-108-C
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 Life Technologies A11055 Dilution: 1:800
Streptavidin Alexa Fluor 405 Life Technologies S32351 Dilution: 1:400
100 µm Filter mesh A. Hartenstein PAS3
LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACS separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACSQuant Analyzer 10 Miltenyi Biotec 130-096-343
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
FACS AriaTMIII BD Biosciences
FACSDiva sofware BD Biosciences
Polypropylene Round bottom tube Falcon 352063
Rneasy plus mini kit Qiagen 74134 RLT lysis buffer is included

References

  1. Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
  2. Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
  3. Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
  4. Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
  5. Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
  6. Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
  7. Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
  8. Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
  9. Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
  10. Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
  11. Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
  12. Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
  13. Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
  14. Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
  15. Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
  16. Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
  17. Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
  18. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
  19. Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).

Play Video

Cite This Article
Julich-Haertel, H., Tiwari, M., Mehrfeld, C., Krause, E., Kornek, M., Lukacs-Kornek, V. Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination. J. Vis. Exp. (120), e55284, doi:10.3791/55284 (2017).

View Video