العزلة وإثراء الكبد السلف مجموعات فرعية تم تحديدها من قبل رواية السطح علامة الجمع
Summary
ويرافق إصابات الكبد عن طريق التوسع خلية سلفية التي تمثل السكان الخلية غير المتجانسة. تصنيف رواية من هذا مقصورة الخلوية يسمح للالمميزة للمجموعات فرعية متعددة. الطريقة الموصوفة هنا يوضح تحليل التدفق الخلوي وعالية العزلة نقاء مختلف مجموعات فرعية والتي يمكن استخدامها لإجراء مزيد من الفحوص.
Abstract
خلال إصابات الكبد المزمنة، الخلايا الاصلية توسع في عملية تسمى رد فعل ductular، الذي ينطوي أيضا على ظهور ارتشاح الخلايا الالتهابية وتنشيط الخلايا الظهارية. ومعظمها تم التحقيق في عدد السكان خلية سلفية أثناء هذه التفاعلات الالتهابية باستخدام علامات سطح واحد، إما عن طريق التحليل النسيجي أو عن طريق تدفق التقنيات التي تعتمد الخلوي. ومع ذلك، علامات سطح رواية حددت مختلف مجموعات فرعية متميزة وظيفيا داخل السلف الكبد / وقف حجرة الخلية. الطريقة المعروضة هنا يصف العزلة وتدفق مفصل الخلوي تحليل مجموعات فرعية السلف باستخدام تركيبات علامة سطح الرواية. وعلاوة على ذلك، فإنه يوضح كيف يمكن أن تكون معزولة مختلف مجموعات فرعية خلية سلفية مع الأساليب القائمة على الفرز نقاء عالية باستخدام الآلي المغناطيسي ونظام مراقبة الأصول الميدانية. الأهم من ذلك، الرواية والأنزيمية مبسط تفكك الكبد يسمح لعزل هؤلاء السكان الخلية نادرة مع قابلية عاليةوهذا هو أعلى بالمقارنة مع الطرق الأخرى القائمة. هذا مهم بشكل خاص لمزيد من الدراسة الخلايا الاصلية في المختبر أو لعزل ذات جودة عالية الحمض النووي الريبي لتحليل الشخصية التعبير الجيني.
Introduction
ويرتبط تجديد الكبد في الغالب مع القدرة الذاتي تجديد خلايا الكبد. ومع ذلك، تحدث إصابات الكبد المزمنة مع تفعيل خلية سلفية والتوسع، والتي ارتبطت مع قدرتها على التمايز إلى خلايا الكبد وcholangiocytes 1، 2، 3، 4. هذا مهم بشكل خاص لأنه، أثناء الإصابات المزمنة، وانتشار خلايا الكبد ليست فعالة. وعلى الرغم من الدراسات تتبع وراثية متعددة تستهدف الخلايا الاصلية، ودورها في تجديد الكبد لا تزال مثيرة للجدل 5، 6، 7، 8. وعلاوة على ذلك، وقد تم ربط تنشيط الخلايا الاصلية لزيادة استجابة التليف في الكبد، مما يثير التساؤلات حول دورها المحدد خلال الإصابات 9، 10.
منذ فترة طويلة واقترح الطبيعة غير المتجانسة للمقصورة خلية سلفية دراسات التعبير الجيني الذي عزل الخلايا الاولية تعبر عن علامة السطح واحدة باستخدام تسليخ مجهري أو خلية على أساس أساليب الفرز 1، 11. في الواقع، في الآونة الأخيرة، رواية الجمع بين علامة السطح باستخدام gp38 (podoplanin) مرتبطة بشكل لا لبس فيه علامات واحدة السابقة الخلايا الاصلية لمختلف مجموعات فرعية 12. الأهم من ذلك، هذه فرعية لا تختلف فقط في التعبير علامة السطح، بل أيضا عرضت التعديلات الوظيفية أثناء الإصابات 12.
وقد استخدمت نماذج حيوانية متعددة للتحقيق في تنشيط الخلايا الاصلية وتجديد الكبد. ويبدو أن أنواع الإصابات المختلفة تعزز تفعيل مجموعات فرعية من الخلايا الاصلية 12 اختلاف. هذا قد يفسر الرقم الهيدروجينيالاختلاف enotypic من رد فعل ductular لوحظ في البشر (4). وهكذا، فإن المظهرية والوظيفية التحليلات المعقدة من الخلايا الاصلية تقوم بدور محوري في فهم دورها في الإصابات والمغزى الحقيقي للتفاعل ductular في أمراض الكبد.
إلى جانب مجموعات علامة السطح، والاختلافات الجوهرية في بروتوكولات العزل الخلية يزيد من تعقيد استنتاجات تستند إلى الدراسات السابقة 2. وهناك كمية كبيرة من الدراسات تناولت دور الخلايا الاولية التي تختلف كثيرا في بروتوكول عزلتهم (على سبيل المثال، التفكك الكبد (مزيج انزيم ومدة العملية)، متوسطة الكثافة، وسرعة الطرد المركزي) 2. تقنية العزل الأمثل، وتوفير قابلية أفضل للسكان الخلية نادرة وتعكس تركيبة فرعية، وقد تم تطوير ونشر مؤخرا 12. والهدف من هذه المقالة هو لتوفير المزيد من ديتبروتوكول ailed من هذا الإجراء عزل خلايا الكبد وتحليل فرعية للسماح لاستنساخ السليم لهذه التقنية. بالإضافة إلى ذلك، يتضمن بروتوكول مقارنة مع أسلوب العزلة السابق للتدليل على الاختلافات بالمقارنة مع البروتوكول الجديد.
Protocol
Representative Results
Discussion
التهاب الكبد والإصابة من أصول مختلفة تؤدي عمليات التجدد في الكبد التي تصاحبها التوسع خلية سلفية وتفعيل 2 و 3. هذه الخلايا الاصلية الكبد تمتلك وقف خصائص الخلية، ومن المرجح تلعب دورا هاما في ميكانيكية حدوث أمراض الكبد المختلفة.
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل جائزة Kovalevskaja مؤسسة Sofja الكسندر فون همبولت إلى فلك.
Materials
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1 % stock solution |
| 10 % BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µl, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µl |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
- Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
- Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
- Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
- Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
- Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
- Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
- Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
- Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
- Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
- Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
- Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
- Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
- Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
- Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
- Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
- Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
- Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).
