Summary

العزلة وإثراء الكبد السلف مجموعات فرعية تم تحديدها من قبل رواية السطح علامة الجمع

Published: February 18, 2017
doi:

Summary

ويرافق إصابات الكبد عن طريق التوسع خلية سلفية التي تمثل السكان الخلية غير المتجانسة. تصنيف رواية من هذا مقصورة الخلوية يسمح للالمميزة للمجموعات فرعية متعددة. الطريقة الموصوفة هنا يوضح تحليل التدفق الخلوي وعالية العزلة نقاء مختلف مجموعات فرعية والتي يمكن استخدامها لإجراء مزيد من الفحوص.

Abstract

خلال إصابات الكبد المزمنة، الخلايا الاصلية توسع في عملية تسمى رد فعل ductular، الذي ينطوي أيضا على ظهور ارتشاح الخلايا الالتهابية وتنشيط الخلايا الظهارية. ومعظمها تم التحقيق في عدد السكان خلية سلفية أثناء هذه التفاعلات الالتهابية باستخدام علامات سطح واحد، إما عن طريق التحليل النسيجي أو عن طريق تدفق التقنيات التي تعتمد الخلوي. ومع ذلك، علامات سطح رواية حددت مختلف مجموعات فرعية متميزة وظيفيا داخل السلف الكبد / وقف حجرة الخلية. الطريقة المعروضة هنا يصف العزلة وتدفق مفصل الخلوي تحليل مجموعات فرعية السلف باستخدام تركيبات علامة سطح الرواية. وعلاوة على ذلك، فإنه يوضح كيف يمكن أن تكون معزولة مختلف مجموعات فرعية خلية سلفية مع الأساليب القائمة على الفرز نقاء عالية باستخدام الآلي المغناطيسي ونظام مراقبة الأصول الميدانية. الأهم من ذلك، الرواية والأنزيمية مبسط تفكك الكبد يسمح لعزل هؤلاء السكان الخلية نادرة مع قابلية عاليةوهذا هو أعلى بالمقارنة مع الطرق الأخرى القائمة. هذا مهم بشكل خاص لمزيد من الدراسة الخلايا الاصلية في المختبر أو لعزل ذات جودة عالية الحمض النووي الريبي لتحليل الشخصية التعبير الجيني.

Introduction

ويرتبط تجديد الكبد في الغالب مع القدرة الذاتي تجديد خلايا الكبد. ومع ذلك، تحدث إصابات الكبد المزمنة مع تفعيل خلية سلفية والتوسع، والتي ارتبطت مع قدرتها على التمايز إلى خلايا الكبد وcholangiocytes 4. هذا مهم بشكل خاص لأنه، أثناء الإصابات المزمنة، وانتشار خلايا الكبد ليست فعالة. وعلى الرغم من الدراسات تتبع وراثية متعددة تستهدف الخلايا الاصلية، ودورها في تجديد الكبد لا تزال مثيرة للجدل 8. وعلاوة على ذلك، وقد تم ربط تنشيط الخلايا الاصلية لزيادة استجابة التليف في الكبد، مما يثير التساؤلات حول دورها المحدد خلال الإصابات 9، 10.

منذ فترة طويلة واقترح الطبيعة غير المتجانسة للمقصورة خلية سلفية دراسات التعبير الجيني الذي عزل الخلايا الاولية تعبر عن علامة السطح واحدة باستخدام تسليخ مجهري أو خلية على أساس أساليب الفرز 11. في الواقع، في الآونة الأخيرة، رواية الجمع بين علامة السطح باستخدام gp38 (podoplanin) مرتبطة بشكل لا لبس فيه علامات واحدة السابقة الخلايا الاصلية لمختلف مجموعات فرعية 12. الأهم من ذلك، هذه فرعية لا تختلف فقط في التعبير علامة السطح، بل أيضا عرضت التعديلات الوظيفية أثناء الإصابات 12.

وقد استخدمت نماذج حيوانية متعددة للتحقيق في تنشيط الخلايا الاصلية وتجديد الكبد. ويبدو أن أنواع الإصابات المختلفة تعزز تفعيل مجموعات فرعية من الخلايا الاصلية 12 اختلاف. هذا قد يفسر الرقم الهيدروجينيالاختلاف enotypic من رد فعل ductular لوحظ في البشر (4). وهكذا، فإن المظهرية والوظيفية التحليلات المعقدة من الخلايا الاصلية تقوم بدور محوري في فهم دورها في الإصابات والمغزى الحقيقي للتفاعل ductular في أمراض الكبد.

إلى جانب مجموعات علامة السطح، والاختلافات الجوهرية في بروتوكولات العزل الخلية يزيد من تعقيد استنتاجات تستند إلى الدراسات السابقة 2. وهناك كمية كبيرة من الدراسات تناولت دور الخلايا الاولية التي تختلف كثيرا في بروتوكول عزلتهم (على سبيل المثال، التفكك الكبد (مزيج انزيم ومدة العملية)، متوسطة الكثافة، وسرعة الطرد المركزي) 2. تقنية العزل الأمثل، وتوفير قابلية أفضل للسكان الخلية نادرة وتعكس تركيبة فرعية، وقد تم تطوير ونشر مؤخرا 12. والهدف من هذه المقالة هو لتوفير المزيد من ديتبروتوكول ailed من هذا الإجراء عزل خلايا الكبد وتحليل فرعية للسماح لاستنساخ السليم لهذه التقنية. بالإضافة إلى ذلك، يتضمن بروتوكول مقارنة مع أسلوب العزلة السابق للتدليل على الاختلافات بالمقارنة مع البروتوكول الجديد.

Protocol

وقد جرت كافة الإجراءات التجريبية بموافقة من الأخلاق ولجان الرعاية الحيوانية من المركز الطبي لجامعة هومبورغ. 1. إعداد المواد والمخازن طازجة إعداد جميع المخازن اللازمة لهضم الكبد ?…

Representative Results

الإجراء المقدمة هنا لهضم الكبد باستخدام مزيج رواية النتائج الانزيمات في تعليق وحيد الخلية التي تحتوي على متني وخلايا الكبد غير متني (الشكلان 1 و 2A). بعد ACK-الناشر خلايا الدم الحمراء، والتدفق المباشر الخلوي تحليل تعليق وحيد الخلية ه…

Discussion

التهاب الكبد والإصابة من أصول مختلفة تؤدي عمليات التجدد في الكبد التي تصاحبها التوسع خلية سلفية وتفعيل 2 و 3. هذه الخلايا الاصلية الكبد تمتلك وقف خصائص الخلية، ومن المرجح تلعب دورا هاما في ميكانيكية حدوث أمراض الكبد المختلفة.

<p class="jov…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل جائزة Kovalevskaja مؤسسة Sofja الكسندر فون همبولت إلى فلك.

Materials

RPMI Life Technologies 21875-034
phenol red free DMEM Life Technologies 31053-028
FBS Life Technologies 10270-106
Collagenase P Sigma-Aldrich 11249002001
DNAse-I Sigma-Aldrich 10104159001
Dispase Life Technologies 17105041
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01
HBSS Life Technologies 14025-050
PBS Sigma-Aldrich D8537
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002 Prepare 1 % stock solution
10 % BSA Miltenyi Biotec 130-091-376
autoMACS Rinsing Solution Miltenyi Biotec 130-091-222 add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice
Phenol-red free DMEM Sigma-Aldrich D1145
counting Beads Count Bright Life Technologies C36950
PI Miltenyi Biotec 130-093-233
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec 130-092-575
anti-CD31 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-097-418
anti-CD45 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-301
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485
CD64 Purified BioLegend 139302 Dilution: 1:100
CD16/32 Purified BioLegend 101302 Dilution: 1:100
CD45 APC/Cy7 BioLegend 103116 Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells
CD31 Biotin BioLegend 102504 Dilution: 1:200, marks endothelial cells
ASGPR1 Purified Bio-Techne AF2755-SP Dilution: 1:100, marks hepatocytes
Podoplanin APC BioLegend 127410 Dilution: 1:1400, marks progenior cells
Podoplanin Biotin BioLegend 127404 Dilution: 1:1400
CD133 PE Miltenyi Biotec 130-102-210 use 3 µl, marks progenitor cells
CD133 Biotin BioLegend 141206 Dilution: 1:100
CD34 Biotin eBioScience 13-0341-81 Dilution: 1:100
CD90.2 Pacific Blue BioLegend 140306 Dilution: 1:800
CD157 PE BioLegend 140203 Dilution: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421 BioLegend 118225 Dilution: 1:100
Sca-1 Biotin Miltenyi Biotec 130-101-885 use 10 µl
Mouse IgG2b, κ PE BioLegend 400311
Rat IgG1 PE BioLegend 400407
Rat IgG2b, κ APC/Cy7 BioLegend 400624
Rat IgG2a, κ Biotin BioLegend 400504
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 BioLegend 400535
Syrian Hamster IgG APC BioLegend 402012
Syrian Hamster IgG Biotin BioLegend 402004
Normal Goat IgG Control Purified Bio-Techne AB-108-C
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 Life Technologies A11055 Dilution: 1:800
Streptavidin Alexa Fluor 405 Life Technologies S32351 Dilution: 1:400
100 µm Filter mesh A. Hartenstein PAS3
LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACS separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACSQuant Analyzer 10 Miltenyi Biotec 130-096-343
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
FACS AriaTMIII BD Biosciences
FACSDiva sofware BD Biosciences
Polypropylene Round bottom tube Falcon 352063
Rneasy plus mini kit Qiagen 74134 RLT lysis buffer is included

References

  1. Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
  2. Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
  3. Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
  4. Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
  5. Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
  6. Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
  7. Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
  8. Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
  9. Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
  10. Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
  11. Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
  12. Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
  13. Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
  14. Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
  15. Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
  16. Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
  17. Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
  18. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
  19. Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).

Play Video

Cite This Article
Julich-Haertel, H., Tiwari, M., Mehrfeld, C., Krause, E., Kornek, M., Lukacs-Kornek, V. Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination. J. Vis. Exp. (120), e55284, doi:10.3791/55284 (2017).

View Video