Isolierung und Anreicherung von Progenitor-Subsets Leber identifiziert durch eine neuartige Oberflächenmarkerkombination
Summary
Leberschädigungen durch Vorläuferzellexpansion begleitet, die eine heterogene Zellpopulation darstellt. Neuartige Klassifizierung dieses Zellkompartiment ermöglicht die Unterscheidung von mehreren Untergruppen. Das hier beschriebene Verfahren zeigt die Durchflusszytometrie-Analyse und hoher Reinheit Isolierung verschiedener Untermengen, die für die weiteren Tests verwendet werden kann.
Abstract
Bei chronischen Leberschädigungen, erweitern Vorläuferzellen in einem Prozess ductularen Reaktion genannt, die auch das Auftreten von entzündlichen Zellinfiltrat und epithelialen Zellaktivierung zur Folge hat. Die Vorläuferzellpopulation während eines solchen Entzündungsreaktionen hat meist worden Markern einzigen Oberfläche untersucht, entweder durch die histologische Analyse oder mittels Durchflusszytometrie-basierte Techniken. Allerdings neuartige Oberflächenmarker verschiedene funktionell unterschiedliche Teilmengen innerhalb der Leber Vorläufer identifiziert / Stammzellfach. Die hier vorgestellten Verfahren beschreibt die Isolierung und detaillierte Durchflusscytometrieanalyse von Vorläuferuntergruppen neuartige Oberflächenmarker-Kombinationen. Darüber hinaus zeigt es, wie die verschiedene Vorläuferzelluntergruppen mit hoher Reinheit mit automatisierten magnetischen und FACS-Sortierung-basierten Methoden isoliert werden. Wichtig ermöglicht, neuartige und vereinfachte enzymatische Dissoziation der Leber für die Isolierung dieser seltenen Zellpopulationen mit hoher Rentabilitätdass überlegen ist im Vergleich zu anderen bestehenden Methoden. Dies ist besonders relevant für die weitere Vorläuferzellen in vitro zu studieren oder hochwertige RNA zur Isolierung des Genexpressionsprofil zu analysieren.
Introduction
Leberregeneration wird meist mit der Selbsterneuerungskapazität von Hepatozyten verbunden. Dennoch treten chronische Leberverletzungen mit Progenitorzellen Aktivierung und Expansion, die mit ihrer Fähigkeit in Verbindung gebracht wurden in Hepatozyten und Cholangiozyten 1, 2, 3, 4 zu unterscheiden. Dies ist besonders relevant, da während der chronischen Verletzungen, Hepatozytenproliferation nicht wirksam ist. Trotz mehrerer Studien genetische Tracing Vorläuferzellen Targeting, ihre Rolle bei der Leberregeneration bleibt umstritten 5, 6, 7, 8. Darüber hinaus hat die Aktivierung von Vorläuferzellen wurden zu einer erhöhten fibrotische Reaktion in der Leber verbunden sind , die während Verletzungen Fragen über ihre genaue Rolle 9 wirft, 10.
Die heterogene Natur des Vorläuferzellkammer ist seit langem von Genexpressionsstudien vorgeschlagen worden , die Vorläuferzellen isoliert eine einzelne Oberflächenmarker exprimieren Mikrodissektion oder Zellsortierung-basierten Methoden 1, 11. Tatsächlich, die vor kurzem eine neuartige Oberflächenmarker Kombination mit gp38 (podoplanin) eindeutig vorherige einzelne Marker der Vorläuferzellen zu verschiedenen Untergruppen 12 verbunden. Wichtig ist , dass nur diese Teilmengen nicht in ihrer Oberflächenmarker Ausdruck unterschieden , sondern auch funktionelle Veränderungen bei Verletzungen 12 ausgestellt.
Mehrere Tiermodelle wurden verwendet, um Vorläuferzellaktivierung und die Leberregeneration untersuchen. Es scheint , dass die verschiedenen Arten von Verletzungen , die Aktivierung verschiedener Untergruppen von Vorläuferzellen 12 zu fördern. Dies könnte die ph erklärenenotypic Divergenz der ductularen Reaktion beim Menschen beobachteten 4. Somit sind die komplexen phänotypische und funktionelle Analysen von Vorläuferzellen Schwenk ihre Rolle bei Verletzungen und die wahre Bedeutung der ductularen Reaktion in Lebererkrankungen zu verstehen.
Neben Oberflächenmarker Kombinationen, erschweren die entscheidenden Unterschiede in der Zellisolierung Protokolle weiter die Basis Schlussfolgerungen zu früheren Studien 2. Eine wesentliche Menge von Studien angesprochen , die Rolle von Vorläuferzellen , die in ihrem Isolierungsprotokoll (zB Leber Dissoziation (Enzymkombination und der Dauer des Prozesses), Dichte Medium und Zentrifugation Geschwindigkeit) stark unterscheiden 2. Eine optimierte Isolationstechnik, eine bessere Rentabilität für seltene Zellpopulationen und reflektierende Teilmenge Zusammensetzung, wurde vor kurzem 12 entwickelt und veröffentlicht. Das Ziel dieses Artikels ist es, eine det zu schaffenailed Protokoll dieser Leberzellisolierungsverfahren und der Teilmenge Analyse für die korrekte Wiedergabe der Technik zu ermöglichen. Zusätzlich weist das Protokoll einen Vergleich mit dem vorherigen Isolierungsverfahren, die Unterschiede zu zeigen, im Vergleich zu dem neuen Protokoll.
Protocol
Representative Results
Discussion
Leberentzündung und Verletzung verschiedener Herkunft auslösen regenerative Prozesse in der Leber , die durch zwei Vorläuferzellexpansion und Aktivierung begleitet werden, 3. Diese Lebervorläuferzellen besitzen Zelleigenschaften stammen und wahrscheinlich eine bedeutende Rolle in der Pathomechanismus verschiedener Lebererkrankungen spielen.
Die Heterogenität der Leber Vorläuferzellen ist seit langem vorgeschlagen worden. Die Ne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Alexander von Humboldt-Stiftung Sofja Kovalevskaja-Preis an VLK unterstützt.
Materials
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1 % stock solution |
| 10 % BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µl, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µl |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
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