L'isolamento e arricchimento di fegato progenitrici sottoinsiemi identificati da un marcatore combinazione romanzo di superficie
Summary
lesioni al fegato sono accompagnate da espansione di cellule progenitrici che rappresenta una popolazione cellulare eterogenea. Classificazione Novel di questo compartimento cellulare consente di distintivo più sottoinsiemi. Il metodo qui descritto illustra l'analisi citofluorimetrica ed elevato isolamento purezza vari sottogruppi che possono essere utilizzati per ulteriori analisi.
Abstract
Durante lesioni croniche del fegato, cellule progenitrici espandono in un processo chiamato reazione duttulare, che comporta anche la comparsa di infiltrato cellulare infiammatorio e l'attivazione delle cellule epiteliali. La popolazione di cellule progenitrici durante tali reazioni infiammatorie è stato per lo più studiata utilizzando marcatori di superficie singoli, sia per l'analisi istologica o con tecniche di citometria a base di flusso. Tuttavia, nuovi marcatori di superficie identificati vari sottoinsiemi funzionalmente distinte all'interno del progenitore di fegato / stelo vano cella. Il metodo presentato qui descrive l'isolamento e il flusso dettagliata analisi di citometria di sottoinsiemi progenitrici utilizzando combinazioni marcatori romanzo di superficie. Inoltre, dimostra come i vari sottogruppi di cellule progenitrici possono essere isolati con metodi di elevata purezza con modalità automatizzate magnetico e FACS ordinamento-based. Importante, novel ed enzimatica semplificato dissociazione del fegato consente l'isolamento di queste popolazioni cellulari rare con un'alta redditivitàche è superiore rispetto ad altri metodi esistenti. Questo è particolarmente rilevante per studiare ulteriormente cellule progenitrici in vitro o per isolare l'RNA di alta qualità per analizzare il profilo di espressione genica.
Introduction
la rigenerazione del fegato è principalmente associato con la capacità di auto-rinnovamento degli epatociti. Tuttavia, le lesioni croniche del fegato si verificano con l'attivazione delle cellule progenitrici e di espansione, che sono stati associati con la loro capacità di differenziarsi in epatociti e colangiociti 1, 2, 3, 4. Questo è particolarmente rilevante in quanto, durante lesioni croniche, epatociti proliferazione non è efficace. Nonostante diversi studi di tracciabilità genetica di targeting cellule progenitrici, il loro ruolo nella rigenerazione del fegato rimane controverso 5, 6, 7, 8. Inoltre, l'attivazione delle cellule progenitrici è stato collegato ad un aumento della risposta fibrotica nel fegato, che solleva domande sul loro ruolo esatto durante lesioni 9, 10.
La natura eterogenea del compartimento di cellule progenitrici è stato a lungo suggerito da studi di espressione genica che isolate cellule progenitrici che esprimono un unico marcatore di superficie utilizzando microdissezione o cella metodi basati su di smistamento 1, 11. Infatti, di recente, una nuova combinazione marcatore superficie con gp38 (podoplanin) inequivocabilmente legata precedenti marcatori singoli di cellule progenitrici di vari sottoinsiemi 12. È importante sottolineare che questi sottoinsiemi non solo differivano nella loro espressione marcatore di superficie, ma anche esposte le alterazioni funzionali durante ferite 12.
Molteplici modelli animali sono stati utilizzati per studiare l'attivazione delle cellule progenitrici e la rigenerazione del fegato. Sembra che i vari tipi di lesioni promuovere l'attivazione di diversi sottoinsiemi di cellule progenitrici 12. Questo potrebbe spiegare il phdivergenza enotypic della reazione duttulare osservato negli esseri umani 4. Così, i complessi fenotipiche e funzionali analisi di cellule progenitrici sono fondamentali per comprendere il loro ruolo nella infortuni e il vero significato della reazione duttulare in malattie del fegato.
Oltre combinazioni marcatore di superficie, le differenze cruciali nei protocolli isolamento delle cellule complicano ulteriormente le conclusioni sulla base di studi precedenti 2. Una notevole quantità di studi affrontato il ruolo delle cellule progenitrici che notevolmente differiscono per il protocollo di isolamento (ad esempio, dissociazione fegato (combinazione enzima e durata del processo), media densità, e la velocità di centrifugazione) 2. Una tecnica di isolamento ottimizzato, fornendo una migliore sopravvivenza per le popolazioni di cellule rare e riflessivo della composizione sottoinsieme, è stato sviluppato e pubblicato di recente 12. Lo scopo di questo articolo è di fornire una più detprotocollo soffriva esattamente di questa procedura di isolamento delle cellule del fegato e il sottoinsieme di analisi per consentire la corretta riproduzione della tecnica. Inoltre, il protocollo include un confronto con il metodo di isolamento precedente per dimostrare le differenze rispetto al nuovo protocollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Infiammazione del fegato e lesioni di diversa origine innescano processi rigenerativi del fegato che sono accompagnati da espansione di cellule progenitrici e l'attivazione 2, 3. Queste cellule progenitrici epatiche possiedono staminali caratteristiche cellulari e probabilmente svolgono un ruolo significativo nel meccanismo patogenetico di varie malattie del fegato.
L'eterogeneità delle cellule progenitrici epatiche è stato…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Alexander von Humboldt Sofja Kovalevskaja premio per VLK.
Materials
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1 % stock solution |
| 10 % BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µl, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µl |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
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