Diese Handschrift beschreibt eine einfache Methode, um die phagosomalen und pH-Bereich sowie die cytoplasmatische pH von menschlichen und Maus-Neutrophilen unter Verwendung des ratiometrischen Indikatoren seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, oder S-1 zu messen. Dies wird in lebenden Zellen konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse erreicht werden.
Neutrophile sind entscheidend angeborene Verteidigung zu hosten und damit auch ein wichtiger Bestandteil der medizinischen Forschung. Phagosom, die intrazelluläre Kompartimente, in denen die Tötung und Verdauung von verschlungen Teilchen stattfinden, ist die Haupt Arena für die Neutrophilen Pathogen Abtötung, die strenge Regulierung erfordert. Phagosomalen pH ist ein Aspekt, sorgfältig gesteuert wird, die wiederum Regulierung antimikrobielle Protease-Aktivität. Viele fluoreszierende pH-sensitive Farbstoffe wurden verwendet, um die phagosomalen Umgebung sichtbar zu machen. S-1 hat mehrere Vorteile gegenüber anderen pH-empfindliche Farbstoffe, einschließlich seiner Doppelemissionsspektren, die Beständigkeit gegen Photobleiche, und seine hohe pKa. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass die neutrophilen phagosome im Vergleich zu anderen Phagozyten ungewöhnlich alkalisch ist. Durch die Verwendung verschiedene biochemische Konjugationen des Farbstoffes können die phagosome aus dem Cytoplasma abgegrenzt werden, so dass Änderungen in der Größe und Form des phagosome beurteilt werden können. Dies ermöglicht es foder eine weitere Überwachung der Ionenbewegung.
Die Neutrophilen sind die häufigste angeborenen Immunzellen im Körper. Seine Hauptfunktion besteht darin , den Blutstrom patrouillieren und Verschlingen und die Fremdpartikel verdauen , dass es in einem Verfahren , wie Phagozytose 1, 2 bekannt , die auftreten können. Die Partikel werden in einem intrazellulären Kompartiment Phagosom genannt abgebaut. Die Aktivierung der neutrophilen NADPH-Oxidase, die Isoform NOX2, initiiert eine Kaskade biochemischer Reaktionen, die in dem Tod des Pathogens gipfelt. NOX2 Proteinuntereinheiten fortfahren in der phagosomalen Membran 3 eine Elektronentransportkette Komplex zu bilden. Einmal aktiviert, es transportiert Elektronen von NADPH durch die Membran zu molekularem Sauerstoff im Innern des phagosome, Superoxidanionen Herstellung und weiteren reaktive Sauerstoffspezies. Dies wird als respiratory burst bekannt, und es wird angenommen , dass für eine effiziente mikrobielle Tötung und Verdauung 2 wesentlich zu sein </sup>. Allerdings ist diese exklusive Bewegung der negativen Ladung durch die Membran würde bald NOX2 inaktivieren, wenn es nicht durch positive Ladung kompensiert bewegen sich in und / oder negative Ladung aus dem phagosome bewegen. Es wurde bekannt, dass die Mehrheit der Ladungsausgleich in den Neutrophilen wird HVCN1 4 durch den Protonenkanal durchgeführt wird , 5. Dieser Kanal ermöglicht die passive Bewegung von Protonen nach unten ihren elektrochemischen Gradienten aus dem Cytosol in die phagosome. Protonenkonzentration wird durch pH reflektiert, so dass für ein gegebenes Niveau der Oxidase-Aktivität kann der pH-Wert im phagosome Messung liefern Informationen über die relative Beteiligung von protonischen und nicht-protonischen Wege in den Ladungsausgleich.
Die humanen neutrophilen phagosome hat einen alkalischen pH – Wert von etwa 8,5 für 20 bis 30 Minuten nach der Phagozytose 5. Dies impliziert die Existenz von zusätzlichen Nicht-Protonen-Ionenkanälen in NOXLadungskompensation 2-induzierten, als Fusion und Freisetzung des Inhalts der sauren Granulat und alleinige Kompensation durch HVCN1 würde ein saures Milieu, im Gegensatz zu dem beobachteten aufrechtzuerhalten. Die Bewegung von Ionen Dieser negative Ladung zu kompensieren, kann auch Änderungen in phagosome Größe über Osmose ausüben. Diese können Ionen anwesend seine in den Neutrophilen bei hohen physiologischen Konzentrationen: Kaliumionen wurden in die phagosome 6 gezeigt zu bewegen, und Chlorid – Ionen – Bewegung ist ein weiterer Kandidat für die Neutrophilen – Funktion wichtig 7.
Die Regulierung des pH – Wertes in dem phagosome ist lebenswichtig für die antimikrobielle Protease – Aktivität 5. Myeloperoxidase (MPO) erscheint bei pH 6 optimale Aktivität zu haben, während für Kathepsin G und Elastase, die optimalen Niveaus sind pH 7-9 und pH 8-10 bzw. 5. Daher kann vorübergehende Veränderung in phagosomalen pH-Aktivitäts Nischen sorgen für verschiedene Enzyme Spaßction. Zu verstehen, wie pH-Wert in Neutrophilen mikrobiellen Tötung beteiligt ist nützliche Informationen für das Design neuer Neutrophilen-Vermehrung mikrobielle Mittel bereitstellen.
Die Neutrophilen phagosome ist ein hochreaktives Umgebung. Dies macht es schwierig, pH-Wert genau zu beurteilen, weil Farbstoffe können leicht oxidiert werden, um technische Artefakte führt. Historisch hat Fluoresceinisothiocyanat (FITC) der Farbstoff der Wahl 8 intrazellulären pH zu messen, 9. Es gibt jedoch einige Nachteile für die Verwendung bei der Messung von Neutrophilen phagosomalen pH-Wert. Es hat einen pKa von 6,4 10, was bedeutet , dass es nur genau verwendet werden kann , um pH – Werte von 5 bis 7,5 8 beurteilen zu können , wie es bei pH <8 11 sättigt. Da die Neutrophilen phagosomalen pH viel mehr alkalisch 5 werden kann, kann FITC nicht das gesamte Spektrum möglicher pH – Änderungen erfassen. Eine weitere signifikippe Problem mit FITC im Rahmen von Neutrophilen ist , dass es angenommen wird , von MPO 12 wurde gebleicht. Die MPO – Inhibitor, Natriumazid, verwendet werden , 13 zu begrenzen , Photobleich, aber es hat sich gezeigt , dass Natriumazid direkt die phagosomalen pH in einem MPO-unabhängigen Weise senkt und ist somit ungeeignet für die Verwendung in solchen Assays 5.
Im Vergleich zu anderen intrazellulären Farbstoffen S-1 hat einen relativ hohen pKa – Wert von 7,5 10. In sauren Bedingungen ist das Molekül protonierten und erzeugt ein Emissionssignal zwischen 560 und 600 nm, wenn sie bei 488 nm oder darüber angeregt werden. Wenn das Molekül in stärker alkalischen Bedingungen deprotoniert wird, ist die Emissionswellenlänge über 600 nm. Ein Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten bei den beiden Wellenlängen zeigt die Emissionsschicht, die mehr ist zuverlässiger als einzelne Fluoreszenzmessungen ist, wie es von Fluorophor-Konzentration und Zellstruktur nicht betroffen ist. S-1 kann an antigenem Material konjugiert werden, wie beispielsweise Zymosan 14, obwohl Hitze abgetöteten (HK) Candida albicans ist bevorzugt, da die größere Oberfläche eines konsistentere Fluoreszenzmesswert ergibt.
Wir haben auch verwendet , eine Modifikation dieses Verfahren zeitliche Veränderungen in pH (Abbildung 3) 5 zu studieren. Dieses Verfahren zur Messung des cytosolischen pH – Wertes kann leicht auf andere Zelltypen angewandt werden, wie an anderer Stelle beschrieben 15, 16, und Zellen , die mit alkalischen Phagosomen 14.
Sobald die entsprechenden Reagenzien, Mikroskop-Einstellungen und Kalibrierungsexperimente aufgebaut werden, ist dieses Verfahren relativ einfach durchzuführen. Die kritischen Schritte umfassen: Markieren des Candida mit S-1 , um sicherzustellen , dass es keine Überlastung des Farbstoffs ist, Kalibrieren, und das Bild wird analysiert.
S-1 ist ein Reagenz , um mehr alkalischen pH – Umgebungen geeignet, die für Neutrophile 21 besonders wichtig ist , sondern beschränkt seine Verwendung in bestimmten Zelltypen. Weitere sauren Umgebungen, wie beispielsweise Makrophagen Phagosomen, SNARF-4 oder S-4, ist besser geeignet wegen seiner niedrigeren pKa 22. Darüber hinaus wird für genauere Ablesungen zytoplasmatische, ist es besser zu nutzen S-4, wie die Standardkurve für S-1 zeigt , dass die Fluoreszenz – Verhältnisse Plateau unterhalb pH 6 (Figur 3) beginnen. Andere Farbstoffe, wie beispielsweise 2' , 7'-Bis- (2-Carboxyethyl) -5- (und-6) -carboxyfluorescein (BCECF) oder pHrodo Red auch geeignet in einem cont sein kannext, die sauer sein soll. Doch die Zytoplasmafärbung ist immer noch notwendig für die korrekte Identifizierung der phagosomes enthält Candida.
Ein wichtiges Merkmal eines phagosomalen pH-Indikator ist, dass es nicht irreversibel durch die reaktive phagosomalen Umgebung verändert wird. S-1 scheint die Neutrophilen Milieu resistent. Dies wird von Levine et al. 5 (siehe Ergänzungs Video 4 von Referenz 5) , welche die Phagozytose und nachfolgende Freisetzung eines S-1-markierter Candida Teilchen durch eine Hvcn1 demonstrieren – / – Neutrophilen. Wenn phagozytiert, schaltet sich das Teilchen von gelb / orange bis rot (neutralen bis alkalischen pH-Wert), jedoch, wenn das Teilchen durch die Neutrophilen freigesetzt wird, kehrt er in seine ursprüngliche Farbe.
Es ist wichtig, einige der Einschränkungen bei der Verwendung von S-1 verbunden zu erwähnen. Die Tatsache, daß dieser Farbstoff beiden Emissionsspektren ermöglicht ratiometrisch meas haturement ist ein Vorteil, aber eine spezielle Ausrüstung benötigt wird, um Bilder zu erfassen; das Mikroskop für die Experimente verwendet wird, muß zwei Bilder gleichzeitig aufnehmen kann, oder mit einer unwesentlichen Zeitverzögerung. Die Autoren gehen davon aus, dass die Forscher dieses Protokoll versucht haben Erfahrung konfokale Mikroskopie, oder haben Zugriff auf eine ausgebildete Fachkraft. Wir können nicht alle spezifischen Mikroskop Parameter auflisten, wie sie für jedes Mikroskop unterscheiden und müssen vom Forscher optimiert werden. Der Acetoxymethylester konjugiert an S-1, dass der Farbstoff in das Zytoplasma diffundieren können durch unspezifische Esterasen im Zytoplasma der Zelle abgebaut das fluoreszierende Molekül zu bilden. Esterasen, wie alkalische Phosphatase, ist in Humanserum und fötales Rinderserum, die verwendet werden, um Zellkulturmedien zu ergänzen. Dementsprechend, in dem das Medium die Zellen, die mit S-1-AM (Abschnitt 4.5) enthalten darf nicht Serum geladen werden. Dies kann eine Herausforderung sein, wenn Zellen verwendet, die eine nährstoff ric erfordernh Medium zu erhalten, sie als die ausgeglichene Salzlösung in diesem Protokoll verwendet. Ähnlich können andere fluoreszierende Mediumkomponenten, wie Phenolrot, kann mit S-1-Messungen stören.
Die Fehlerbalken in Figur 3 zeigen , dass es bei jedem pH gewissen Variation im Verhältnis von Messungen ist. Eine geeignete Anzahl von Wiederholungen jeden Experiment (mindestens n = 3) und so viele Einzelmessungen in jedem einzelnen Experiment werden die Inter-vakuolären Variation zu überwinden benötigt. Es ist daher ratsam , den pH – Wert von mindestens 100 Phagosomen für jede Bedingung und ebenso viele phagosomalen Bereichen zu messen , die nur eine Candida zu enthalten scheinen. Die Phagosomen zur Quantifizierung zu mess sollten diejenigen sein , die eine Candida Teilchen vollständig verschlungen haben (dh jene , vollständig von Zytoplasma umgeben). Zur Milderung gegen unbeabsichtigte Verzerrungen bei der Auswahl von Zellen / phagosomes zur Quantifizierung sollten alle Analysen werden durchgeführt, währendblind für die experimentellen Bedingungen.
Hier beschreiben wir die Isolierung von Neutrophilen durch Dextransedimentation von Vollblut, gefolgt von einer Zentrifugation der Plasmaschicht durch eine Dichtegradienten. Wir verwenden diese Technik, da sie schnell und effizient eine reine (> 95%) Population von Neutrophilen produziert, obwohl es auch anderen Methoden zur Verfügung, wie zum Beispiel Vollblut Zentrifugation durch andere Dichtegradienten Formeln oder negative Selektion von Neutrophilen mit einem speziellen Kits mit Antikörpern oder magnetischen Perlen. Jedoch kann diese für die meisten Gruppen unerschwinglich teuer sein, die Neutrophilen routinemäßig zu isolieren. Außerdem verwenden wir das Antikoagulans Heparin in dem Blutsammelröhrchen, während andere Forscher mehr daran gewöhnt sein können Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Säure-Citrat-Natrium (ACD) zu verwenden. Da es viele verschiedene Methoden zur Auswahl, ist es auf die persönliche Präferenz des Forschers auf.
Außerdem,bei der Isolierung und Manipulation von Neutrophilen sie sollten mit Vorsicht behandelt werden, um übermäßige Aktivierung zu vermeiden. Vorsorgliche Schritte umfassen: nur Plastikgeschirr verwendet wird, kein Glas; Filter-Sterilisieren alle Puffer jegliche verunreinigende Endotoxin zu entfernen; beim Spinnen Neutrophilen sicherstellen, dass die Zentrifuge gut ausgewogen ist übermäßige Vibrationen zu vermeiden; so weit wie möglich begrenzt die Zeit Neutrophilen bleiben in einem Pellet nach Zentrifugation; Neutrophile nicht in Lösung von mehr als 5 x 10 6 / ml beizubehalten; und führt das Experiment so bald wie möglich nach der Isolierung.
Dieses Verfahren kann angepasst werden, um Veränderungen im pH-Wert und phagosomalen Bereich über die Zeit zu messen, indem ein beheiztes Bühnenbild bis 37 ° C auf dem Mikroskop und Schnappschüsse einmal all 30-60 s von der gleichen Position einnehmen, da für die Kalibrierungsschritte beschrieben. Es könnte theoretisch auch für höhere Durchsatzexperimente angepasst werden, wie zum Beispiel in 96-Well-Platten und für die Durchflusszytometrie Experimente, in denen S-1 kannals pH – Indikator 23 verwendet werden. Bei diesen Einstellungen wird die Betonung der individuellen Zellaktivität durch eine globale Wirkung auf die Zellpopulation ersetzt.
Dieses Verfahren zielt darauf ab, einen relativ einfachen Versuchsaufbau zur Verfügung zu stellen, auf denen einzelne Forscher anpassen können ihr Interessengebiet gerecht zu werden. Forscher wollen können Neutrophilen phagosomalen pH und Umgebung zu erkunden, während auch die Bewegung der anderen Ionen zu messen, beispielsweise die intrazelluläre Calciumkonzentration. Es gibt mehrere fluoreszierende Indikatoren Ca 2+ leicht zugänglich für die konfokale Mikroskopie, wie beispielsweise Indo-1, die auch Doppelemissionsspektren bei 400 und 475 nm 24 hat. Diese Emissionswellenlängen nicht überlappen, mit S-1-Emissionsspektren, aber die Anregungswellenlänge ist im ultravioletten (UV) Ende des Spektrums, die Zellen schädlich sein kann, und ein UV-Laser ist auf allen Mikroskopen nicht alltäglich. Eine umfassende Überprüfung der verschiedenen Indikatoren zuMessung der intrazellulären Kalziumfluss wird von Takahashi et al abgedeckt. 25 und Hillson et al. 26.
Schließlich gibt es noch andere Methoden zur Verfügung phagosomalen pH unter Verwendung verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe wie Nunes et al zu messen. 27, 28 haben 13 sowie andere Gruppen demonstriert. Andere Forscher haben ebenfalls verwendet S-1 cytosolischen pH 29 oder pH 14 phagosomalen zu messen. Jedoch ist dieses Protokoll einzigartiges gleichzeitig den pH – Wertes von sowohl Cytosol und phagosome bei der Messung, die die Möglichkeit bietet , Änderungen in phagosomalen Querschnittsfläche zu beobachten , und zwischen Wildtyp- und Hvcn1 zu unterscheiden – / – Maus Neutrophilen und menschliche Neutrophilen mit und ohne eine Arbeits NADPH-Oxidase.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde uns freundlicherweise vom Wellcome Trust, der Biotechnologie und Biologische Wissenschaften Research Council und der Irwin Joffe Memorial Fellowship finanziert.
Candida albicans ATCC 10231 Vitroids 80 CFU | Sigma-Aldrich | RQC14003-10EA | Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions |
YPD broth | Sigma-Aldrich | Y1375 | Follow manufacturer's instructions, various providers exist |
Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000 | MP Biomedicals | 2101514 | Use gloves |
Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000IU/ml | Fannin, Wockhardt UK Ltd | FP1077 | We purchased from UCH inpatient pharmacy |
SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester – Special Packaging | Thermo Scientific/Invitrogen | SS22801 | Use gloves |
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Thermo Scientific/Invitrogen | C1272 | Use gloves |
Vivaglobin human IgG 160mg/ml solution | CSL Behring | received as a gift | Various providers exist |
Normal mouse serum | Abcam | ab7486 | Various providers exist |
Lymphoprep (density gradient medium) | Alere Ltd | 1114547 | Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque |
Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Toxic, use gloves, various providers exist |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Toxic, use gloves, various providers exist |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
Magnesium sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | Various providers exist |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Various providers exist |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Various providers exist |
Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | Various providers exist |
Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
Diphenylene iodonium (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Various providers exist |
Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 | Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate |
Poly L lysine | Sigma | P4707 | Various providers exist |
Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700) | Carl Zeiss | The microscope must be able to excite at 555nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600nm, >610nm) | |
Ibidi µ slide 8 well ibiTreat | Thistle Scientific | IB-80826 | Other appropriate imaging dishes can be substituted |
Fluorodish Cell Culture Dish-35mm, 23mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | Other appropriate imaging dishes can be substituted, different sizes are available |
Soniprep 150 | MSE | Any appropriate sonicator will suffice | |
TC20 Automated Cell Counter | BioRad | Various providers exist | |
1.5ml Protein LoBind Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs |