Questo manoscritto descrive un metodo semplice per misurare il pH phagosomal e zona così come il pH citoplasmatico di neutrofili umani e di topo usando l'indicatore raziometrico seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, o S-1. Ciò si ottiene mediante live-cell microscopia confocale a fluorescenza e analisi di immagine.
I neutrofili sono cruciali per ospitare la difesa innata e, di conseguenza, costituiscono un importante settore della ricerca medica. Phagosome, compartimento intracellulare dove l'uccisione e digestione delle particelle inghiottito avvengono, è l'arena principale per neutrofili patogeno uccisione che richiede stretta regolazione. Phagosomal pH è un aspetto che è attentamente controllata, a sua volta regolare l'attività della proteasi antimicrobica. Molti coloranti pH-sensibile fluorescenti sono stati utilizzati per visualizzare l'ambiente phagosomal. S-1 ha diversi vantaggi rispetto ad altri coloranti pH-sensibile, compreso il suo spettro di emissione duplice, la sua resistenza a foto-candeggio, e la sua elevata pKa. Usando questo metodo, abbiamo dimostrato che phagosome neutrofili è insolitamente alcalino rispetto ad altri fagociti. Utilizzando differenti coniugazioni biochimici del colorante, phagosome può essere delineata dal citoplasma in modo che i cambiamenti nelle dimensioni e la forma del phagosome possono essere valutati. Questo permette di fo ulteriore monitoraggio del movimento ionico.
Il neutrofili è il più abbondante cellula immunitaria innata del corpo. La sua funzione principale è costituito pattugliano sangue e inghiottendo e digerendo le particelle estranee che potrebbe verificarsi in un processo noto come fagocitosi 1, 2. Le particelle vengono degradati in un compartimento intracellulare chiamato phagosome. L'attivazione di neutrofili NADPH ossidasi, la NOX2 isoforma, avvia una cascata di reazioni biochimiche che culmina nella morte del patogeno. Subunità proteiche NOX2 procedere per formare un complesso di catena di trasporto degli elettroni nella membrana phagosomal 3. Una volta attivato, trasporta elettroni dal NADPH attraverso la membrana all'ossigeno molecolare all'interno phagosome, producendo anioni superossido e specie di ossigeno reattive ulteriormente. Questo è noto come il burst respiratorio, ed è pensato per essere essenziale per un efficiente uccisione microbica e la digestione 2 </sup>. Tuttavia, questo movimento esclusivo di carica negativa attraverso la membrana presto inattivare NOX2 se non fosse compensato da carica positiva trasferirsi e / o carica negativa muoversi dalla phagosome. È stato ben stabilito che la maggior parte di compensazione di carica nella neutrofili è effettuato dal canale protone HVCN1 4, 5. Questo canale permette il movimento passivo di protoni il loro gradiente elettrochimico dal citosol phagosome. concentrazione protonica è riflessa dal pH, quindi per un dato livello di attività ossidasi, misurando il pH nel phagosome può fornire informazioni sulla relativa partecipazione di percorsi protonici e non protonici a compensazione di carica.
Neutrofili phagosome umano ha un pH alcalino di circa 8,5 per 20-30 min dopo fagocitosi 5. Ciò implica l'esistenza di ulteriori canali non-protone ioni di NOX2-indotta compensazione di carica, come la fusione e il rilascio del contenuto dei granuli acidi e suola compensazione di HVCN1 manterrebbe un ambiente acido, a differenza di quello osservato. Il movimento di ioni per compensare questa carica negativa possono anche esercitare cambiamenti nelle dimensioni fagosoma osmosi. Questi possono essere ioni presenti nel neutrofili ad alte concentrazioni fisiologiche: ioni potassio hanno dimostrato di trasferirsi nella phagosome 6, e cloruro di movimento ionico è un altro candidato importante per la funzione dei neutrofili 7.
La regolazione del pH nel phagosome è vitale per antimicrobica attività proteasica 5. Mieloperossidasi (MPO) sembra avere attività ottimale a pH 6, mentre per catepsina G e elastasi, i livelli ottimali sono pH 7-9 e pH 8-10, rispettivamente 5. Pertanto, il cambiamento transitoria del pH phagosomal può fornire nicchie di attività per i diversi enzimi per divertimentoction. Capire come il pH è coinvolto in neutrofili uccisione microbica può fornire informazioni utili per la progettazione di nuovi agenti microbici neutrofili-aumentare.
Il phagosome neutrofili è un ambiente altamente reattivo. Ciò rende difficile valutare con precisione pH, perché coloranti possono essere facilmente ossidati, portando ad artefatti tecnici. Storicamente, isotiocianato di fluoresceina (FITC) è stata la tintura di scelta per misurare intracellulare pH 8, 9. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi per il suo utilizzo nella misurazione del pH dei neutrofili phagosomal. Esso ha un pKa di 6,4 10, il che significa che si può solo accuratamente essere utilizzato per valutare i livelli di pH compreso fra 5 7.5 8, come si satura a pH <8 11. Come il pH dei neutrofili phagosomal può diventare molto più alcalino 5, FITC non può catturare l'intera gamma di potenziali variazioni di pH. Un ulteriore signifiproblema sopraelevazione con FITC nel contesto di neutrofili è che è pensato per essere fotodecolorate da MPO 12. L'inibitore MPO, azide di sodio, può essere utilizzato per limitare photobleaching 13, ma è stato dimostrato che la sodio azide, riduce direttamente il pH phagosomal in modo MPO indipendente ed è quindi inadatto per l'uso in tali saggi 5.
Rispetto ad altri coloranti intracellulari, S-1 ha una relativamente alta pKa di 7.5 10. In condizioni acide, la molecola è protonata e produce un segnale di emissione di 560 a 600 nm quando viene eccitato a 488 nm o superiore. Quando la molecola è deprotonato in condizioni più alcalini, la lunghezza d'onda di emissione è superiore a 600 nm. Un rapporto delle intensità di fluorescenza a queste due lunghezze d'onda indica lo spostamento di emissione, che è più affidabile rispetto sia singole misure di fluorescenza, come è influenzato dalla concentrazione fluoroforo e struttura cellulare. S-1 può essere coniugato a materiale antigenico, come zymosan 14, anche se ucciso al calore (HK) Candida albicans è preferito, come la superficie maggiore dà una lettura di fluorescenza più coerente.
Abbiamo usato anche una variante di questo metodo per studiare variazioni temporali di pH (Figura 3) 5. Questo metodo per la misura del pH citosolico può essere facilmente applicato ad altri tipi di cellule, come descritto altrove 15, 16, e cellule con fagosomi più alcalini 14.
Una volta che i reagenti appropriati, impostazioni del microscopio, ed esperimenti di calibrazione vengono impostati, questo metodo è relativamente semplice da eseguire. I passaggi critici comprendono: etichettatura Candida con S-1 per garantire che non vi sia sovraccarico del colorante, taratura, e l'analisi dell'immagine.
S-1 è un reagente adatto a più ambienti a pH alcalino, che è particolarmente importante per i neutrofili 21 ma ne limita l'utilizzo in alcuni tipi di cellule. Per gli ambienti più acidi, come macrofagi, fagosomi SNARF-4, o S-4, è più adatto a causa della sua bassa pKa 22. Inoltre, per le letture citoplasmatici più accurate, è meglio usare S-4, come curva standard per S-1 mostra che i rapporti di fluorescenza cominciano a pianoro sottostante pH 6 (figura 3). Altri coloranti, quali 2' , 7'-bis- (2-carbossietil) -5- (e-6) -Carboxyfluorescein (BCECF) o pHrodo Red possono anche essere più adatto in un context che dovrebbe essere acide. Ancora la colorazione citoplasma è ancora necessaria per la corretta individuazione dei fagosomi contenenti Candida.
Una caratteristica importante di un indicatore di pH phagosomal è che non trasformazione irreversibile dall'ambiente phagosomal reattivo. S-1 sembra essere resistente al milieu dei neutrofili. Ciò è dimostrato dal Levine et al. 5 (vedi complementare Video 4 su riferimento 5), che dimostrano la fagocitosi e il successivo rilascio di una particella Candida S-1 marcato da un Hvcn1 – / – neutrofili. Quando fagocitati, la particella passa da giallo / arancio a rosso (neutro a pH alcalino), ma quando la particella viene rilasciato dal neutrofili, ritorna al suo colore originale.
È importante ricordare alcune delle limitazioni associate all'utilizzo S-1. Il fatto che questo colorante ha due spettri di emissione permettendo meas raziometricheurement è un vantaggio, ma attrezzature specialistiche è necessaria per acquisire immagini; il microscopio utilizzato per gli esperimenti deve essere in grado di registrare due immagini simultaneamente o con un ritardo insignificante. Gli autori supporre che il ricercatore di tentare questo protocollo ha esperienza usando la microscopia confocale, o ha accesso a un professionista qualificato. Non possiamo elencare tutti i parametri del microscopio specifici poiché essi variano per ciascun microscopio e devono essere ottimizzate dal ricercatore. L'estere acetossimetil coniugato S-1 che permette il colorante di diffondersi nel citoplasma cellulare è degradata da esterasi non specifiche nel citoplasma cellulare per formare la molecola fluorescente. Esterasi, quali fosfatasi alcalina, sono presenti nel siero umano e siero bovino fetale, che vengono utilizzati per integrare mezzi di coltura cellulare. Di conseguenza, il mezzo in cui le cellule vengono caricate con S-1-AM (paragrafo 4.5) non deve contenere siero. Questo potrebbe rivelarsi difficile se utilizzando cellule che richiedono una maggiore sostanza-rich di media per sostenere loro che la soluzione salina bilanciata utilizzata in questo protocollo. Analogamente, altri componenti medie fluorescenti, quali rosso fenolo, possono interferire con S-1 misurazioni.
Le barre di errore in figura 3 indicano che v'è una certa variazione nelle misurazioni del rapporto ad ogni pH. Un numero adeguato di ripetizioni di ogni esperimento (almeno n = 3) e sono necessari come molte misure individuali in ogni singolo esperimento per superare la variabilità inter-vacuolare. È pertanto consigliabile misurare il pH di almeno 100 fagosomi per ogni condizione e altrettante aree phagosomal che sembrano contenere un solo Candida. Fagosomi da misurare per la quantificazione dovrebbero essere quelli che hanno completamente inghiottito una particella Candida (cioè quelle completamente circondato da citoplasma). Per mitigare contro pregiudizi non intenzionali nella selezione di cellule / fagosomi per la quantificazione, tutte le analisi devono essere eseguite mentrecieco alle condizioni sperimentali.
Qui, descriviamo l'isolamento dei neutrofili per sedimentazione destrano di sangue intero e centrifugazione dello strato di plasma attraverso un gradiente di densità. Usiamo questa tecnica come modo rapido ed efficiente produce una popolazione puro (> 95%) di neutrofili, anche se ci sono altri metodi disponibili, come tutta la centrifugazione del sangue attraverso altre formule gradiente di densità o selezione negativa di neutrofili utilizzando kit specializzati con anticorpi o magnetico perline. Tuttavia, quest'ultimo può essere proibitivo per la maggior parte dei gruppi che isolano neutrofili di routine. Inoltre, usiamo l'eparina anticoagulante nel tubo di raccolta sangue, mentre altri ricercatori può essere più abituati a usare acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) o sodio citrato acido (ACD). Come ci sono molti metodi diversi tra cui scegliere, spetta alla preferenza personale del ricercatore.
Inoltre,quando isolare e manipolare neutrofili devono essere maneggiati con una certa cura per evitare eccessiva attivazione. misure precauzionali includono: solo con oggetti in plastica, nessun vetro; filtrata sterilizzare tutti i tamponi per rimuovere eventuali contaminanti endotossina; quando neutrofili filatura assicurarsi che la centrifuga è ben equilibrato per evitare vibrazioni eccessive; limitare il più possibile i neutrofili tempo rimangono in un pellet dopo centrifugazione; non mantenere in soluzione neutrofili superiore a 5 x 10 6 / ml; ed eseguire l'esperimento non appena possibile dopo l'isolamento.
Questo metodo può essere atto a misurare variazioni dell'area di pH e phagosomal nel tempo utilizzando una scenografia riscaldata a 37 ° C sul microscopio e prendendo istantanee volta ogni 30-60 s dalla stessa posizione, come descritto per la fase di calibrazione. Potrebbe anche teoricamente essere adattato per esperimenti superiore throughput, come in piastre da 96 pozzetti, e per citometria a flusso esperimenti, dove S-1 puòessere usata come indicatore di pH 23. Tuttavia, in queste impostazioni, l'accento sull'attività singola cella viene sostituito da un effetto più globale sulla popolazione di cellule.
Questo metodo ha lo scopo di fornire una relativamente semplice apparato sperimentale su cui i singoli ricercatori possono adattare alle loro area di interesse. Ricercatori potrebbe voler esplorare neutrofili phagosomal pH e la zona mentre anche misurando movimento di altri ioni, per esempio, la concentrazione di calcio intracellulare. Ci sono diversi fluorescenti Ca 2+ indicatori prontamente disponibili per la microscopia confocale, come indo-1, che ha anche spettri doppia emissione a 400 e 475 nm 24. Queste lunghezze d'onda di emissione non si sovrappongono con S-1 spettri di emissione, ma la lunghezza d'onda di eccitazione è alla fine ultravioletta (UV) dello spettro, che possono essere dannosi per le cellule, e un laser UV non è comune a tutti i microscopi. Una rassegna completa dei diversi indicatorimisurare flusso di calcio intracellulare è coperto da Takahashi et al. 25 e Hillson et al. 26.
In conclusione, ci sono altri metodi disponibili per misurare il pH phagosomal utilizzando diversi coloranti fluorescenti come Nunes et al. hanno dimostrato 13 come pure altri gruppi 27, 28. Altri ricercatori hanno utilizzato anche S-1 per misurare citosolico pH 29 o phagosomal pH 14. Tuttavia, questo protocollo è unica nel misurare simultaneamente il pH sia citosol e phagosome, che prevede la possibilità di osservare variazioni phagosomal sezione trasversale e distinguere tra tipo selvatico e Hvcn1 – / – neutrofili topo, e neutrofili umani con e senza lavorando NADPH ossidasi.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato gentilmente finanziato dal Wellcome Trust, la Biotecnologia e Scienze Biologiche Research Council, e l'Irwin Joffe Memorial Fellowship.
Candida albicans ATCC 10231 Vitroids 80 CFU | Sigma-Aldrich | RQC14003-10EA | Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions |
YPD broth | Sigma-Aldrich | Y1375 | Follow manufacturer's instructions, various providers exist |
Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000 | MP Biomedicals | 2101514 | Use gloves |
Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000IU/ml | Fannin, Wockhardt UK Ltd | FP1077 | We purchased from UCH inpatient pharmacy |
SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester – Special Packaging | Thermo Scientific/Invitrogen | SS22801 | Use gloves |
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Thermo Scientific/Invitrogen | C1272 | Use gloves |
Vivaglobin human IgG 160mg/ml solution | CSL Behring | received as a gift | Various providers exist |
Normal mouse serum | Abcam | ab7486 | Various providers exist |
Lymphoprep (density gradient medium) | Alere Ltd | 1114547 | Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque |
Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Toxic, use gloves, various providers exist |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Toxic, use gloves, various providers exist |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
Magnesium sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | Various providers exist |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Various providers exist |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Various providers exist |
Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | Various providers exist |
Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
Diphenylene iodonium (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Various providers exist |
Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 | Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate |
Poly L lysine | Sigma | P4707 | Various providers exist |
Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700) | Carl Zeiss | The microscope must be able to excite at 555nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600nm, >610nm) | |
Ibidi µ slide 8 well ibiTreat | Thistle Scientific | IB-80826 | Other appropriate imaging dishes can be substituted |
Fluorodish Cell Culture Dish-35mm, 23mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | Other appropriate imaging dishes can be substituted, different sizes are available |
Soniprep 150 | MSE | Any appropriate sonicator will suffice | |
TC20 Automated Cell Counter | BioRad | Various providers exist | |
1.5ml Protein LoBind Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs |