Dit manuscript beschrijft een eenvoudige methode om de pH en phagosomal gebied en het cytoplasmatische pH van mens en muis neutrofielen via de ratiometrische indicator seminaphthorhodafluor (SNARF) -1 of S-1 te meten. Dit wordt bereikt met behulp van levende cellen confocale fluorescentie microscopie en beeldanalyse.
Neutrofielen zijn cruciaal voor aangeboren afweer hosten en dus een belangrijk gebied van het medisch onderzoek vormen. De phagosome, het intracellulaire compartiment waar het doden en spijsvertering van overspoeld deeltjes plaatsvinden, is de belangrijkste arena voor neutrofielen ziekteverwekker doden dat strakke regulering nodig. Phagosomal pH is een aspect dat nauwkeurig wordt geregeld op zijn beurt reguleren antimicrobiële proteaseactiviteit. Veel fluorescerende pH-gevoelige kleurstoffen zijn gebruikt om de phagosomal omgeving te visualiseren. S-1 heeft verscheidene voordelen boven andere pH-gevoelige kleurstoffen, zoals de dubbele emissiespectra, de weerstand tegen foto-bleking en de hoge pKa. Met behulp van deze methode, hebben we aangetoond dat de neutrofielen phagosome is ongewoon alkalisch in vergelijking met andere fagocyten. Door verschillende biochemische vervoegingen van de kleurstof, kan de phagosome worden afgebakend uit het cytoplasma, zodat veranderingen in de grootte en vorm van de phagosome kan worden beoordeeld. Dit maakt fof verdere controle van ionenbeweging.
De neutrofielen is het meest voorkomende aangeboren immuunsysteem cel in het lichaam. Zijn hoofdfunctie bestaat uit patrouilleren de bloedbaan en overspoelt en digestie van het vreemde deeltjes die het kan tegenkomen in een proces dat fagocytose 1, 2. De deeltjes worden afgebroken in een intracellulair compartiment genaamd phagosome. De activering van neutrofielen NADPH oxidase, de isovorm Nox2, initieert een cascade van biochemische reacties die culmineert in de dood van de ziekteverwekker. Nox2 eiwitsubeenheden gaan tot een elektronentransportketen complex in de phagosomal membraan 3 te vormen. Eenmaal geactiveerd, transporteert elektronen van NADPH door het membraan van moleculaire zuurstof in de phagosome, produceren superoxide anionen en andere reactieve zuurstofsoorten. Dit staat bekend als de respiratory burst, en men denkt van essentieel belang voor een efficiënte microbiële doden en spijsvertering 2 te zijn </sup>. Dit zou echter exclusieve beweging van negatieve lading over het membraan snel inactiveren Nox2 als deze niet werden gecompenseerd door positieve lading bewegen in en / of negatieve lading verhuizen van de phagosome. Het is bekend dat de meeste ladingscompensatie in neutrofielen door het proton kanaal HVCN1 4, 5 wordt gedragen. Dit kanaal maakt het passieve beweeglijkheid van protonen beneden de elektrochemische gradiënt van het cytosol naar de phagosome. Protonconcentratie wordt gereflecteerd door de pH, zodat voor een gegeven oxidase activiteit meting van de pH in de fagosoom kan informatie over de relatieve deelname van protonzuren en niet-protonische trajecten leiding compensatie.
De menselijke neutrofiel phagosome een alkalische pH van bij benadering 8,5 gedurende 20-30 minuten na fagocytose 5. Dit impliceert het bestaan van aanvullende niet-protonen ionkanalen in NOX2-geïnduceerde lading compensatie, als de fusie en het vrijkomen van de inhoud van de zure korrels en enige compensatie door HVCN1 zou een zuur milieu te handhaven, in tegenstelling tot die waargenomen. De beweging van ionen deze negatieve lading kan ook via osmose veranderingen in phagosome maat uitoefenen compenseren. Deze aanwezig in neutrofielen bij hoge fysiologische concentraties kunnen ionen: kaliumionen bleken te verplaatsen naar de phagosome 6 en chloride ionen beweging andere kandidaat belang neutrofielfunctie 7.
De regulering van de pH in de phagosome is van vitaal belang voor antimicrobiële protease-activiteit 5. Myeloperoxidase (MPO) lijkt optimale activiteit hebben bij pH 6, terwijl voor cathepsine G en elastase, de optimale niveaus zijn pH 7-9 en pH 8-10, respectievelijk 5. Daarom kan er een voorbijgaande verandering in phagosomal pH activiteit niches voor verschillende enzymen om plezierctie. Inzicht in hoe pH is betrokken bij neutrofielen microbiële doden, kunnen nuttige informatie voor het ontwerpen van nieuwe-neutrofielen verhogen van microbiële agenten.
De neutrofielen phagosome is een zeer reactieve omgeving. Dit maakt het moeilijk om de pH nauwkeurig te beoordelen, omdat de kleurstoffen gemakkelijk kan worden geoxideerd, wat leidt tot technische artefacten. Historisch gezien is fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) de kleurstof gekozen intracellulaire pH 8, 9 meten. Er zijn echter een aantal nadelen voor het gebruik ervan bij het meten van neutrofielen phagosomal pH. Met een pKa van 6,4 10, wat betekent dat het slechts nauwkeurig kan worden toegepast om pH waarden te beoordelen 5-7,5 8, zoals verzadigt bij pH <8 11. Omdat de neutrofielen phagosomal pH veel meer alkalisch 5 kan worden, kan FITC het volledige scala van mogelijke pH wijzigingen niet vast te leggen. Een verdere significant probleem met FITC in de context van neutrofielen is dat men denkt te photobleached door MPO 12. De MPO inhibitor, natriumazide, kan worden gebruikt te beperken fotobleken 13, maar het is aangetoond dat natriumazide rechtstreeks verlaagt de pH phagosomal per MPO-onafhankelijk en is dus ongeschikt voor gebruik in dergelijke assays 5.
Vergeleken met andere intracellulaire kleurstoffen, S-1 een relatief hoge pKa van 7,5 10. Onder zure omstandigheden, het molecuul geprotoneerd en vormt een emissiesignaal tussen 560 en 600 nm bij excitatie bij 488 nm of daarboven. Wanneer het molecuul gedeprotoneerd in meer alkalische omstandigheden, de emissiegolflengte is dan 600 nm. Een verhouding van de fluorescentie-intensiteiten bij deze twee golflengten geeft de emissie verschuiven, die meer betrouwbaar is dan één fluorescentiemetingen, omdat het ongevoelig fluorofoor concentratie en celstructuur. S-1 kan worden geconjugeerd aan antigeen materiaal, bijvoorbeeld zymosan 14, hoewel hitte gedode (HK) Candida albicans heeft de voorkeur, aangezien de grotere oppervlakte geeft een consistentere fluorescentie aflezing.
We hebben ook een modificatie van deze werkwijze temporele veranderingen in pH studie (figuur 3) 5. Deze methode voor het meten van cytosolische pH kan gemakkelijk worden toegepast op andere celtypen, zoals elders beschreven 15, 16, en cellen met meer alkalisch phagosomes 14.
Zodra de geschikte reagentia, microscoop instellingen en kalibratie experimenten worden opgezet, deze methode is relatief eenvoudig uit te voeren. De kritische stappen omvat: het labelen van de Candida S-1 zodat er geen overbelasting van de kleurstof, kalibreren en analyseren van het beeld.
S-1 is een reagens geschikt voor meer basische pH omstandigheden, hetgeen vooral van belang voor neutrofielen 21 maar beperkt het gebruik ervan in bepaalde celtypen. Meer zure omgevingen zoals macrofaag fagosomen, SNARF-4 of S-4, geschikter vanwege de lagere pKa 22. Bovendien, voor nauwkeurigere metingen cytoplasma, is het beter om S-4 gebruikt, aangezien de standaardcurve voor S-1 blijkt dat de fluorescentie verhoudingen gaan plateau onder pH 6 (figuur 3). Andere kleurstoffen, zoals 2' , 7'-bis- (2-carboxyethyl) -5- (en-6) -carboxyfluoresceïne (BCECF) of pHrodo Red kan ook geschikt zijn een context dat naar verwachting zuur te zijn. Maar het cytoplasma kleuring steeds nodig zijn om correcte identificatie van de phagosomes met Candida.
Een belangrijk kenmerk van een phagosomal pH-indicator is dat het niet onomkeerbaar is veranderd door de reactieve phagosomal milieu. S-1 lijkt bestand tegen de neutrofielen milieu zijn. Dit wordt aangetoond door Levine et al. 5 (zie aanvullende Video 4 van referentie 5), die de fagocytose en daarop volgende afgifte van een S-1 gemerkte Candida deeltjes door een Hvcn1 tonen – / – neutrofielen. Wanneer gefagocyteerd, het deeltje verandert van geel / oranje naar rood (neutrale tot alkalische pH), maar wanneer het deeltje wordt vrijgegeven door de neutrofielen, keert hij terug naar zijn oorspronkelijke kleur.
Het is belangrijk om een aantal beperkingen van het gebruik van S-1 vermeld. Dat deze kleurstof twee emissiespectra waardoor ratiometrische measurement is een voordeel, maar specialistische apparatuur nodig is om beelden te verwerven; de microscoop gebruikt voor de experimenten moeten kunnen twee beelden gelijktijdig of met een onbeduidend vertraging opneemt. De auteurs gaan ervan uit dat de onderzoeker een poging dit protocol heeft ervaring met behulp van confocale microscopie, of toegang heeft tot een getrainde professional. We kunnen niet een lijst van alle specifieke microscoop parameters zoals ze verschilt per microscoop en moeten worden geoptimaliseerd door de onderzoeker. De acetoxymethylester geconjugeerd aan S-1 waarmee de kleurstof diffundeert in het cytoplasma afgebroken door niet-specifieke esterasen in het cytoplasma naar het fluorescerende molecuul. Esterasen, zoals alkalische fosfatase, aanwezig in humaan serum en foetaal runderserum, die worden gebruikt ter aanvulling celkweekmedia. Bijgevolg moet het medium waarin de cellen worden geladen met S-1-AM (4.5) geen serum. Dit kan moeilijk blijken als het gebruik van cellen die een meer voedselrijke ric vereisenh medium te houden dan de gebalanceerde zoutoplossing gebruikt in dit protocol. Evenzo kunnen andere fluorescerende mediumcomponenten, zoals fenol rood, kunnen interfereren met S-1 gemeten.
De foutbalken in figuur 3 geven aan dat er enige variatie in de verhouding metingen bij elke pH. Een geschikt aantal herhalingen van elk experiment (ten minste n = 3) en evenveel afzonderlijke metingen in elk afzonderlijk experiment nodig zijn tussen vacuolaire variatie overwinnen. Derhalve is het raadzaam om de pH van ten minste 100 phagosomes voor elke omstandigheid en evenveel phagosomal gebieden die lijken enige Candida bevatten meten. De phagosomes te meten voor kwantificering moeten zijn die volledig zijn overspoeld een Candida deeltje (dwz die volledig omringd door cytoplasma). Af te zwakken tegen onbedoelde vertekening bij de selectie van cellen / phagosomes voor kwantificering, moeten alle analyses worden uitgevoerd alsblind voor de experimentele omstandigheden.
Hier beschrijven we de isolatie van neutrofielen door dextran sedimentatie van volbloed gevolgd door centrifugatie van de plasmalaag door een dichtheidsgradiënt. Wij gebruiken deze techniek het snel en efficiënt produceert een zuiver (> 95%) populatie neutrofielen, hoewel er andere methoden, zoals volbloed centrifugatie door andere dichtheidsgradiënt formules of negatieve selectie van neutrofielen via gespecialiseerde kits met antilichamen of magnetische kralen. Echter, de laatste onbetaalbaar voor de meeste groepen die neutrofielen routinematig isoleren. Daarnaast gebruiken we het antistollingsmiddel heparine in de bloedafnamebuis, terwijl andere onderzoekers meer gewend aan het gebruik van ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) of zuur citraat natrium (ACD) kan zijn. Omdat er veel verschillende methoden om uit te kiezen, is het aan de persoonlijke voorkeur van de onderzoeker.
Voortswanneer het isoleren en manipuleren van neutrofielen ze moeten worden behandeld met enige zorg aan bovenmatige activering te voorkomen. Voorzorgsmaatregelen zijn onder meer: alleen met behulp van plastic waren, geen glas; filter-steriliseren alle buffers één verontreinigend endotoxine te verwijderen; bij het draaien van neutrofielen zorg ervoor dat de centrifuge is goed uitgebalanceerd om overmatige trillingen te vermijden; zo beperkt mogelijke tijd neutrofielen blijven in een pellet na centrifugatie; niet neutrofielen in de oplossing van meer dan 5 x 10 6 / mL te handhaven; en het uitvoeren van de proef zo spoedig mogelijk na isolatie.
Deze werkwijze kan worden aangepast aan veranderingen in de pH en phagosomal gedurende een bepaalde tijdsperiode te meten met behulp van een verwarmde decor tot 37 ° C op de microscoop en het nemen van momentopnamen eens 30-60 s vanuit dezelfde positie, zoals beschreven voor de ijkingsstappen. Het kan theoretisch ook worden aangepast voor hogere doorvoer experimenten, zoals in 96-putjesplaten en voor flowcytometrie-experimenten, waarbij S-1 kanworden gebruikt als pH-indicator 23. Echter, in deze instellingen, de nadruk op individuele celactiviteit wordt vervangen door een meer globale effect op de cel bevolking.
Deze methode is gericht op een relatief eenvoudige experimentele opstelling waarop individuele onderzoekers kunnen aanpassen aan hun gebied van belang aan te passen te bieden. Onderzoekers willen neutrofielen phagosomal pH en omgeving verkennen en tegelijkertijd meten van verplaatsing van andere ionen, bijvoorbeeld intracellulaire calciumconcentratie. Er zijn verschillende fluorescente Ca2 + indicatoren beschikbaar voor confocale microscopie, zoals Indo-1, die ook dual emissiespectra bij 400 tot 475 nm 24. Deze emissiegolflengten niet overlappen met S-1 emissiespectra, maar de excitatiegolflengte is bovenaan ultraviolet (UV) uiteinde van het spectrum, die schadelijk voor cellen en een UV laser niet gebruikelijk bij alle microscopen. Een uitgebreid overzicht van de verschillende indicatorenmeten intracellulair calcium flux onder Takahashi et al. 25 en Hillson et al. 26.
Tot slot zijn er andere methoden beschikbaar om phagosomal pH meten met verschillende fluorescente kleurstoffen Nunes et al. hebben aangetoond 13 en andere groepen 27, 28. Andere onderzoekers hebben ook S-1 te meten cytosol pH 29 of pH phagosomal 14. Echter, dit protocol is uniek gelijktijdig de pH van zowel cytosol en phagosome, die de mogelijkheid om veranderingen in phagosomal dwarsdoorsnedeoppervlak observeren en om onderscheid te maken tussen wildtype en Hvcn1 levert – / – muis neutrofielen en humane neutrofielen met en zonder werken NADPH oxidase.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd vriendelijk gefinancierd door de Wellcome Trust, de biotechnologie en Biological Sciences Research Council, en de Irwin Joffe Memorial Fellowship.
Candida albicans ATCC 10231 Vitroids 80 CFU | Sigma-Aldrich | RQC14003-10EA | Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions |
YPD broth | Sigma-Aldrich | Y1375 | Follow manufacturer's instructions, various providers exist |
Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000 | MP Biomedicals | 2101514 | Use gloves |
Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000IU/ml | Fannin, Wockhardt UK Ltd | FP1077 | We purchased from UCH inpatient pharmacy |
SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester – Special Packaging | Thermo Scientific/Invitrogen | SS22801 | Use gloves |
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Thermo Scientific/Invitrogen | C1272 | Use gloves |
Vivaglobin human IgG 160mg/ml solution | CSL Behring | received as a gift | Various providers exist |
Normal mouse serum | Abcam | ab7486 | Various providers exist |
Lymphoprep (density gradient medium) | Alere Ltd | 1114547 | Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque |
Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Toxic, use gloves, various providers exist |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Toxic, use gloves, various providers exist |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
Magnesium sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | Various providers exist |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Various providers exist |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Various providers exist |
Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | Various providers exist |
Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
Diphenylene iodonium (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Various providers exist |
Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 | Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate |
Poly L lysine | Sigma | P4707 | Various providers exist |
Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700) | Carl Zeiss | The microscope must be able to excite at 555nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600nm, >610nm) | |
Ibidi µ slide 8 well ibiTreat | Thistle Scientific | IB-80826 | Other appropriate imaging dishes can be substituted |
Fluorodish Cell Culture Dish-35mm, 23mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | Other appropriate imaging dishes can be substituted, different sizes are available |
Soniprep 150 | MSE | Any appropriate sonicator will suffice | |
TC20 Automated Cell Counter | BioRad | Various providers exist | |
1.5ml Protein LoBind Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs |