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Immunology and Infection

Imágenes de la Neutrófilos Fagosoma y el citoplasma usando un indicador de pH Ratiometric

Published: April 05, 2017
doi:
10.3791/55107
, , , ,
1Centre for Molecular Medicine, Division of Medicine,University College London, 2Cell and Developmental Biology,University College London

Summary

Este manuscrito describe un método simple para medir el pH phagosomal y zona, así como el pH citoplasmático de los neutrófilos humanos y de ratón utilizando el indicador radiométrica seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, o S-1. Esto se consigue utilizando células vivas microscopía de fluorescencia confocal y análisis de imágenes.

Abstract

Los neutrófilos son cruciales para la defensa del huésped innata y, en consecuencia, constituyen un área importante de la investigación médica. El fagosoma, el compartimento intracelular cuando el sacrificio y la digestión de las partículas envueltos tienen lugar, es el principal escenario para matar patógenos de neutrófilos que requiere una regulación estricta. Phagosomal pH es un aspecto que se controla cuidadosamente, a su vez la regulación de la actividad de proteasa antimicrobiana. Muchos colorantes fluorescentes sensibles al pH se han utilizado para visualizar el entorno phagosomal. S-1 tiene varias ventajas sobre otros colorantes sensibles al pH, incluyendo sus espectros de emisión dual, su resistencia a la foto-blanqueo, y su alto pKa. Usando este método, hemos demostrado que el fagosoma de neutrófilos es inusualmente alcalina en comparación con otros fagocitos. Mediante el uso de diferentes conjugaciones bioquímicas del tinte, el fagosoma puede ser delineada desde el citoplasma de modo que los cambios en el tamaño y la forma del fagosoma se pueden evaluar. Esto permite fo aún más el seguimiento de movimiento iónico.

Introduction

El neutrófilo es el más abundante de células inmune innata en el cuerpo. Su función principal consiste en patrullando el torrente sanguíneo y que envuelve y digerir las partículas extrañas que se puede encontrar en un proceso conocido como fagocitosis 1, 2. Las partículas se degradan en un compartimiento intracelular llamada fagosoma. La activación de la NADPH oxidasa de los neutrófilos, la isoforma NOX2, inicia una cascada de reacciones bioquímicas que culmina en la muerte del patógeno. Subunidades de la proteína NOX2 proceden a formar un complejo de la cadena de transporte de electrones en la membrana phagosomal 3. Una vez activado, que transporta electrones desde NADPH través de la membrana al oxígeno molecular dentro del fagosoma, produciendo aniones superóxido y especies más reactivas de oxígeno. Esto se conoce como el estallido respiratorio, y se cree que es esencial para la destrucción microbiana eficaz y la digestión 2 </sup>. Sin embargo, este movimiento exclusivo de carga negativa través de la membrana pronto inactivar NOX2 si no se compensa con carga positiva que se mueve en y / o carga negativa se mueve fuera del fagosoma. Ha sido bien establecido que la mayoría de compensación de carga en el neutrófilo se lleva a cabo por el canal de protones HVCN1 4, 5. Este canal permite el movimiento pasivo de protones abajo de su gradiente electroquímico del citosol en el fagosoma. concentración de protones se refleja por el pH, por lo que para un nivel dado de actividad oxidasa, midiendo el pH en el fagosoma puede proporcionar información sobre la participación relativa de las vías protónicos y no protónicos en compensación de carga.

El fagosoma de neutrófilos humanos tiene un pH alcalino de aproximadamente 8,5 durante 20-30 min después de la fagocitosis 5. Esto implica la existencia de los canales iónicos no de protones adicionales en NOX2 inducida por compensación de carga, como la fusión y la liberación de los contenidos de los gránulos de ácidos y única compensación por HVCN1 sería mantener un ambiente ácido, en contraste a la observada. El movimiento de los iones para compensar esta carga negativa también puede ejercer cambios en el tamaño fagosoma a través de ósmosis. Estos pueden ser iones presentes en el recuento de neutrófilos a altas concentraciones fisiológicas: iones de potasio se han demostrado para moverse en el fagosoma 6, y el movimiento iónico cloruro es otro candidato importante para la función de neutrófilos 7.

La regulación de pH en el fagosoma es vital para la actividad proteasa antimicrobiana 5. Mieloperoxidasa (MPO) parece tener una actividad óptima a pH 6, mientras que para la catepsina G y elastasa, los niveles óptimos son pH 7-9 y pH 8-10, respectivamente 5. Por lo tanto, el cambio en el pH transitoria phagosomal puede proporcionar nichos de actividad de diferentes enzimas para la diversióncción. La comprensión de cómo pH está implicado en la destrucción microbiana de neutrófilos puede proporcionar información útil para el diseño de agentes microbianos neutrófilos aumentar novedosas.

El fagosoma de neutrófilos es un entorno altamente reactivo. Esto hace que sea difícil evaluar con precisión el pH, ya que los tintes se pueden oxidar fácilmente, lo que lleva a los artefactos técnicos. Históricamente, isotiocianato de fluoresceína (FITC) ha sido el colorante de elección para medir intracelular pH 8, 9. Sin embargo, hay algunas desventajas para su uso en la medición de pH de neutrófilos phagosomal. Tiene un pKa de 6,4 10, lo que significa que solamente precisa se puede utilizar para evaluar los niveles de pH de 5 a 7,5 8, ya que satura a pH <8 11. A medida que el pH de neutrófilos phagosomal puede llegar a ser mucho más alcalina 5, FITC no puede capturar toda la gama de posibles cambios de pH. A signifi ademásproblema no puede con FITC en el contexto de los neutrófilos es que se cree que está photobleached por MPO 12. El inhibidor de la MPO, azida de sodio, se puede utilizar para limitar photobleaching 13, pero se ha demostrado que la azida de sodio reduce directamente el pH phagosomal de una manera MPO-independiente y es por lo tanto inapropiada para su uso en tales ensayos 5.

En comparación con otros colorantes intracelulares, S-1 tiene un relativamente alto pKa de 7,5 10. En condiciones ácidas, la molécula es protonada y produce una señal de emisión entre 560 y 600 nm cuando se excita a 488 nm o superior. Cuando la molécula se desprotona en condiciones más alcalinas, la longitud de onda de emisión es de más de 600 nm. Una relación de las intensidades de fluorescencia a estas dos longitudes de onda indica el cambio de la emisión, que es más es fiable que las mediciones de fluorescencia individuales, ya que no se ve afectada por la concentración de fluoróforo y estructura de la célula. S-1 se puede conjugar con material antigénico, tal como zymosan 14, aunque se prefiere matado por calor (HK) Candida albicans, como el área de superficie más grande da una lectura de fluorescencia más consistente.

También hemos utilizado una modificación de este método para estudiar los cambios temporales en pH (Figura 3) 5. Este método para la medición de pH citosólico se puede aplicar fácilmente a otros tipos de células, como se describe en otra parte 15, 16, y las células con los fagosomas más alcalinos 14.

Protocol

declaración de la ética: Todo el trabajo con animales se llevó a cabo con la licencia y la aprobación del Ministerio del Interior del Reino Unido. La participación humana en esta investigación fue aprobado por los Comités Conjuntos UCL / UCLH de Ética de la Investigación Humana. Todos los participantes dieron su consentimiento informado. 1. Preparación de C. albicans Crecer un disco Candida (ver Lista de Materiales) en una placa de agar YPD según las instrucciones del fabricante. Escoja una colonia y añadirla a 15 ml de caldo YPD. Incubar en una incubadora de agitación a 30 ° C y 200 rpm hasta que el caldo está nublado (por lo general alrededor de 2 días, o hasta una concentración de aproximadamente más de 1 x 10 9 / ml). Centrifugar el medio Candida y resuspender en 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Centrifugar a 3000 xg durante 10 min. Repita este paso dos veces. Colocar el tubo que contiene 50 ml de medio PBS / Candida en un baño de agua precalentado a 60 ° C de modo que todo el tubo es submerged durante 1 h. Para confirmar que la Candida son muertas por calor, racha una muestra sobre una placa de agar YPD y se incuba durante la noche a 30 ° C. Ajustar la concentración (HK) Candida muertos por calor a 5-9 x 10 8 / ml, dependiendo del crecimiento de Candida, y almacenarla en alícuotas de 1 ml en un congelador a -20ºC. NOTA: Todos los recuentos de células en este protocolo se realizaron usando un contador de células automatizado. 2. S-1 de acoplamiento a muertos por calor (HK) Candida Preparar una alícuota de carboxi-S-1 de éster de succinimidilo (50 mg) por diluyéndolo en 100 l de sulfóxido de dimetilo de alto grado (DMSO). Vortex bien para mezclar. Preparar 1 ml de 1 x 10 8 HK Candida en bicarbonato de sodio 0,1 M (pH 8,3) en un tubo de 15 ml. Añadir 100 ml de carboxi-S-1 una gota a la vez para el HK Candida mientras se mezcla en un vórtice en aproximadamente 2.000 rpm (de media a alta velocidad). Envolver foi de aluminiol alrededor del tubo y colocarlo en un rodillo a temperatura ambiente durante 1 h. Lavar el HK Candida- S-1 (HKC-S-1) tres veces por centrifugación a 2250 xg durante 10 min cada uno. Para los dos primeros lavados, resuspender el precipitado en 15 ml de bicarbonato de sodio 0,1 M (pH 8,3). Después del tercer lavado, resuspender en 1 ml de tampón de equilibrado solución de sal (BSS) (véase la Tabla 1). La transferencia de los HKC-S-1 de suspensión en tubos en alícuotas de 100 mu l y almacenar a -20 ° C. NOTA: Use tubos con baja superficie del material de unión, de ser posible, como HKC-S-1 partículas pueden adherirse a la pared de tubos de centrífuga normales. Opsonizar HKC-S-1 Para los neutrófilos humanos, añadir 100 l de suero de IgG humana a 100 l de descongeladas HKC-S-1. Para los neutrófilos de ratón, añadir 50 l de suero de ratón normal y 50 l de suero de ratón inmune Candida (generada a partir de ratones C57B6 inyectados con HK Candida) de 5 a 100 lde HKC-S-1. Mezclar a fuego-agitador a 37 ° C y 1100 rpm durante 60-90 min, y luego en un rodillo de 4 ° C durante 2 h. Lavar tres veces en tampón BSS por centrifugación a 17.200 xg durante 1 min cada uno. Resuspender en 100 l de tampón BSS. 3. Aislamiento de neutrófilos Para los neutrófilos de sangre periférica humana, tomar 15 ml de sangre por punción venosa de un donante sano y colocarlo en una jeringa de 20 ml que contiene 90 l de solución de heparina sódica IU / ml 1000 (60 l de heparina / 10 ml de sangre). Utilizando una punta de pipeta, inyectar 1,5 ml de solución de dextrano al 10% en la jeringa. Invertir suavemente 3 veces y dejarlo en posición vertical en el banco. Espere 30-60 min, hasta que la sangre se divide aproximadamente en un medio, con una capa de la capa leucocitaria superior que es de color pajizo y una capa inferior que contiene los eritrocitos. Con cuidado, empujar hacia fuera la capa superior a través de una aguja o quitarlo con una punta de pipeta. Póngalo itubo na 15 mL. Evitar sacar la capa roja. Usando una pipeta de 5 ml, añadir 34 ml de medio de gradiente de densidad (véase la Lista de Materiales) a la parte inferior del tubo bajo la capa de la capa leucocitaria para obtener dos capas distintas. Centrifugar a 913 xg durante 10 min. NOTA: Si utilizando neutrófilos de ratón (véase la referencia 17 para el aislamiento de neutrófilos de ratón), utilice la suspensión de células que ha sido purgado de la médula ósea en su lugar. Retirar el sobrenadante, dejando tras de sí una bolita roja. Suavemente vórtice perturbar el sedimento. Añadir 7 ml de agua destilada, H autoclave 2 O al sedimento y se invierte durante 20 s para resuspender el sedimento. Añadir 7 ml de solución salina 2x e invertir varias veces para mezclar, la lisis de los glóbulos rojos restantes. Centrifugar a 300 xg durante 5 min. Verter el sobrenadante y resuspender el sedimento en tampón BSS a aproximadamente 4 x 10 6 / ml. NOTA: Para la microscopía óptima de las células, mantener la concentración de la suspensión celular entre 1,5-6 x 10 6 </sup> / ml. 4. Preparación de Diapositivas Pre-tratamiento de una placa de microscopía de 8 pocillos (ver Lista de Materiales) con 200 l de poli-L-lisina (solución 0,01%) en cada pocillo durante 40-60 min a temperatura ambiente. Eliminar la poli-L-lisina (puede ser reutilizado) y lavar los pocillos dos veces con 200? L de H2O destilada Añadir 200? L de suspensión celular preparada en la etapa 3.6 a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 30-60 min. Preparar una alícuota de 5- (y-6) -carboxi S-1 acetoximetilo (S-1-AM) éster (50 g) mediante la adición de 100 l de DMSO de alto grado a un tubo. Vortex para mezclar. Cuando no está en uso, se almacena a -20 ° C. En un pequeño tubo, añadir 1,7 ml de tampón BSS y 20 l de S-1-AM. Vortex para mezclar. Lavar los pocillos dos veces con 200 l de tampón BSS, y luego sustituir el tampón con la solución de S-1-AM. Tenga cuidado de no perturbar la monocapa de células unidas a la parte inferior del pozo con la pipeta suavementeabajo de las paredes de los pocillos. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 25 min. Lavar los pocillos dos veces con 200! L de tampón BSS. Para probar un inhibidor, hacer una "mezcla maestra" del fármaco apropiado en tampón BSS. Lavar los pocillos dos veces en la solución de inhibidor. Nota: asegúrese de usar la misma cantidad de vehículo de la droga (por ejemplo, DMSO o etanol) en el control así como se utilizó para el inhibidor. Si probar el efecto de cloruro de zinc, utilizar tampón BSS carente KH 2 PO 4 (el HEPES puede tamponar la solución solo), como zinc precipita con fosfato. Sonicar la opsonizado HKC-S-1 (sección 6.2) durante aproximadamente 3 s a 5 m de amplitud. Añadir 10 l a cada pocillo. Incubar la placa a 37 ° C durante 15-20 min para permitir la fagocitosis, por lo que las células listo para ser fotografiado para instantáneas de la fagocitosis. 5. Microscopía Confocal Utilizando un microscopio confocal, ajustar la longitud de onda del láser de modo XXen las células se excitan a 555 nm y la emisión se detecta mediante dos canales, o detectores: 560-600 nm y más de 600 nm. NOTA: Los parámetros específicos de microscopio serán diferentes para cada microscopio y necesitan ser optimizados por el investigador. Ver las células usando un lente de 63X con aceite. Utilizar una imagen de baldosas de exploración de la configuración continua para ver el mosaico central. El uso de la intensidad de fluorescencia y la ganancia de los canales detectores, ajustar el enfoque y la intensidad del láser y la ganancia de los dos canales para optimizar la imagen. Dividir la imagen utilizando la configuración para ver los dos canales; verificar que no hay saturación de la intensidad de fluorescencia en el citoplasma o vacuolas. Saturación aparece como puntos rojos. Reducir la intensidad del láser para que haya un número mínimo de puntos de color rojo, pero las células y los fagosomas son lo suficientemente brillante como para ver con claridad. Una vez satisfecho, haga clic en "Iniciar experimento." Se genera una imagen de barrido 9-azulejo. Guardar la imagen como un archivo complejo recomendado porel software que contiene una imagen compuesta de los dos canales (no JPEG o TIFF). 6. experimentos de calibración Construir la curva estándar de pH con Candida solo. Preparar los tampones de pH de 3,0 a 13,0, según la Tabla 1. Tomar una alícuota (100! L) de HKC-S-1. Girar hacia abajo durante 1 min a 17.200 x g. Resuspender en 500 l de la memoria intermedia asignada. A partir de la gama de pH más bajo, añadir la suspensión a un pre-tratado bien (de la etapa 4.2). Colocar el portaobjetos en el microscopio confocal en un escenario de calefacción ajustada a 37 ° C. Registre la fluorescencia cada min durante 10 min. Repita este procedimiento para cada buffer. La saponina curva estándar. Aislar 1 x 10 7 neutrófilos humanos 5 y volver a suspender en 1 ml del tampón de pH más bajo. Seguir el método descrito en la sección 4 para medir ppH hagosomal en los neutrófilos. Después de la incubación con la suspensión de Candida durante 20 min, añadir 0,3% de saponina (15! L de 10% de valores para una pre-tratado bien (de la etapa 4.2)) para el plato, y luego se incuba durante 20 min a 37 ° C. Tome una imagen cada minuto durante 10 minutos. Repita este procedimiento para cada buffer. Citosólicos curvas estándar pH utilizando el alto K + / técnica de 5, 18, 19 nigericina. Se llevan los tampones descritos en la Tabla 1, a partir de pH de 4,0 a 13.0. Siga los pasos 4,1-4,7, dejando sólo los neutrófilos en los pocillos pretratados – cada pocillo para contener un tampón diferente. Añadir la corredera a la etapa calienta 37 ° C y registrar la fluorescencia cada min durante 10 min. Nota: Puede tomar algún tiempo para que el pH citosólico se estabilice con la solución externa, pero después de este punto, el valor de la relación S-1 se convierteconstante. La medición de los extracelulares HKC-S-1 en cada experimento puede servir como un control para comprobar que cualquier inhibidor añadido no interfieren con la fluorescencia emitida S-1 o afectan el pH del tampón. Análisis 7. Imagen NOTA: En este caso, se proporcionan instrucciones para el análisis de imágenes (cuantificación de la fluorescencia) utilizando el software libre ImageJ. Se recomienda el uso de ImageJ. Descargar e instalar la versión ImageJ> 1.46r según las instrucciones de los desarrolladores (https://imagej.nih.gov/ij/). Instalar el archivo de código complementario que se adjunta con este protocolo llamado “medición phagosomal.” Abrir imagen J y cargue el archivo de imagen elegido para el análisis en la barra de herramientas. Para combinar los dos canales, utilice la imagen> Color> Hacer compuesto. Haga clic para seleccionar un archivo en el que almacenar los resultados. Haga clic en la herramienta de línea en la barra de herramientas y haga doble clic para aumentar el ancho a & #34; 2 ". Dibujar una línea a través del ancho de un fagosoma y, a continuación, el botón derecho para "medida pH". La intensidad media de los dos canales se adquiere, y su relación se calcula automáticamente por el archivo de código en ImageJ. Después de terminar las mediciones, haga clic para seleccionar "guardar archivo". Para medir el área fagosoma, utilice el cuarto icono de la barra de herramientas para dibujar a mano alzada por la zona. Haga clic para seleccionar "área de medida." NOTA: Los resultados se guardan y un archivo de registro se genera en el directorio seleccionado. Los resultados pueden ser procesados ​​usando la hoja de cálculo, R, o un software equivalente. La relación entre la proporción de fluorescencia a pH es de aproximadamente sigmoidal, y los valores de la relación generados por el análisis ImageJ se puede convertir a pH utilizando una función logística o sigmoide generalizada o por interpolación lineal o spline cúbico. Para medir el citoplasma, dibujar una línea a través del citoplasma y haga clic derecho para “medir el pH”.

Representative Results

La Figura 1 presenta instantáneas de los neutrófilos de diferentes orígenes para demostrar entornos phagosomal variables. Para facilitar el análisis cuantitativo, es importante para sembrar los pocillos con un número apropiado de células: demasiados hará que las células a la capa sobre la otra, lo que hace difícil ver fagosomas cerrados con precisión; muy pocos voluntad, por supuesto, proporcionar un menor número de resultados, especialmente en lo que no todos los neutrófilos se fagocitar. La Figura 2 es una imagen que está sobre-saturado; esto puede ser evaluada mediante la división de la imagen entre sus dos canales (utilizando el software del microscopio se recomienda en la Lista de materiales o un equivalente) – puntos rojos muestran dónde se ha detectado la fluorescencia máxima. Esto puede ser contrarrestado mediante la reducción de la intensidad del láser. Las curvas de calibración utilizando los diversos sistemas de tampón se muestran en la Figura 3, adaptado de Levine et al. 5 </ Sup>. Las barras de error muestran que existe alguna variación en la fluorescencia entre las lecturas. La figura 4 da un ejemplo de cómo podrían presentarse los datos de pH phagosomal y el área. Este enfoque permite que cada medición individual que se muestra con un diagrama de caja sobre-puesta. Sin embargo, los datos también se podrían mostrar en un gráfico de barras de histograma. Figura 1: imágenes de instantánea adecuado de los neutrófilos de los seres humanos y ratones. En el extremo derecho es una clave visual cualitativa del color aproximado de los fagosomas teñidos con S-1 correspondientes al pH. El color amarillo indica más acidez, mientras que el rojo indica más alcalinidad. (A) muestra Hvcn1 – / – neutrófilos de médula ósea de ratón 20 min después de la fagocitosis. Los fagosomas parecen muy roja, alcalina, y se hinchan. La flecha roja en la parte inferior derecha de laimagen apunta a un Candida intracelular, mientras que la flecha en los puntos superior izquierda a una partícula extracelular. (B) muestra los neutrófilos de médula ósea de ratón de tipo salvaje que han ingerido Candida; que son mucho menos alcalino que Hvcn1 – células – /. (C) muestra los neutrófilos de sangre periférica humana en el mismo punto después de la fagocitosis. Aparecen ligeramente más alcalino que las células de tipo salvaje del ratón, pero los fagosomas son todavía no es tan grande y rojo como el Hcvn1 – células – /. (D) muestra los neutrófilos humanos que han fagocitado Candida en presencia de 5 yodonio M difenileno (DPI). Todos los fagosomas son muy ácida, con un pH de 6 o menos; el fármaco inhibe la NADPH oxidasa, lo que no hay movimiento de los iones de compensación. Los protones liberados de los gránulos de ácidos que se fusionan a la fagosoma hacen que el pH ácido 20, y aumento de la contratación de la V-ATPasa a the membrana phagosomal tras el tratamiento con DPI 9. El citoplasma también aparece más alcalino en comparación con las células de las otras condiciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Over-saturación de Hvcn1 – neutrófilos de médula ósea de ratón – /. Es importante excluir de las imágenes de análisis en el que los datos de fluorescencia son-over saturada. Como se describe en la sección 5.3, la imagen compuesta se divide en dos imágenes (arriba a la izquierda, flecha roja) con ambos canales presentados individualmente. En este software, indicador de rango se comprueba en (parte inferior izquierda, flecha roja), entonces los píxeles que son sobre-saturada son de color rojo brillante. Hay sobre-saturación presente en ambos canales (1 y 2). Un magnificación de algunas células y extracelular Candida se muestra en la parte inferior derecha, con flechas que apuntan a las áreas afectadas. El análisis de estos puntos conduciría a una medición radiométrica falsa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: curvas de calibración estándar para la conversión de S-1 coeficientes de fluorescencia a las mediciones de pH. Las curvas estándar para Candida solo en los diferentes tampones (etiquetados como "Tris") y cuando las células se permeabilizan con saponina ( "saponina") son muy similares, lo que demuestra que el S-1 de lectura dentro y fuera de la célula (fagosoma y extracelular medio) son comparables. Las barras de error representan la media ± SD. La curva S-1 relación / pH se acorta cuando se prueba in el citoplasma ( "citoplasma"), que debe ser tomado en consideración en el análisis de imágenes. Esta figura se ha modificado a partir de Levine et al. 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Cuantificación de pH phagosomal y el área. Esta figura presenta un ejemplo de presentación de datos. Las gráficas se generaron usando el software de programación R. A: muestra la relación phagosomal y pH correspondiente para A (Hvcn1 – / – ratón neutrófilos de médula ósea), B: neutrófilos de médula ósea de ratón de tipo salvaje, C: los neutrófilos de sangre periférica humana, y D: humana neutrófilos con 5? M DPI n = 3/300. Las mediciones individuales se muestran como cuadrados pequeños, con una superposición gráfica de caja con mediuna y rango intercuartil. Una barra roja representa la media. Como se ve en las imágenes en la Figura 1, Hvcn1 – / – células tiene los fagosomas muy alcalinas en comparación con el ratón de tipo salvaje y los neutrófilos humanos. También tienen un área más grande phagosomal (Figura 4B, n = 3/300). fagosomas de neutrófilos humanos son ligeramente más alcalino y más grande que los neutrófilos de tipo salvaje del ratón, mientras que los neutrófilos humanos incubados con DPI tienen fagosomas muy ácidos y pequeñas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Solución salina equilibrada de tampón (BSS) NaCl 156 mM KCl 3 mM MgSO4 2 mM KH 2 PO 4 1,25 mM CaCl2 2 mM Glucosa 10 mM Hepes 10 mM pH 7,4 con NaOH o HCl caldo de YPD caldo de YPD 50 gramos Agua destilada 1 L Autoclave a 121 ° C durante 15 min Para agar YPD: antes de esterilizar añadir 15 g / l de agar Solución de dextrano 10% grado clínico dextrano 50 gramos NaCl <td> 4,5 g Agua destilada 500 ml Añadir a la botella de vidrio y autoclave a 121 ° C durante 15 min Solución salina 2x NaCl 18 g Agua destilada 1 L Añadir a la botella de vidrio y autoclave a 121 ° C durante 15 min 10% de la saponina tampón BSS 50 ml saponina 5 g tampón BSS de calor a 37 ° C, añadir saponina y mezclar. Añadir 0,1% de azida de sodio como conservante, mezcla se almacena a 4 ° C. </ Tr> tampones de calibración Candida curva estándar En primer lugar hacer hasta 0,15 m stock de cada búfer Compensar solución 0,15 M de NaCl 15 ml de volumen final: 5 ml 0,15 M de solución tampón deseada + 10 ml de solución de NaCl 0,15 M pH 3 NaCl 100 mM glicina 50 mM pH 4 NaCl 100 mM acetato 50 mM pH 5 NaCl 100 mM acetato 50 mM pH 6 NaCl 100 mM acetato 50 mM pH 7 NaCl 100 mM Tris 50 mM pH 8 NaCl 100 mM Tris 50 mM pH 9 NaCl 100 mM Tris 50 mM pH 10 NaCl 100 mM glicina 50 mM pH 11 NaCl 100 mM fosfato 50 mM pH 12 NaCl 100 mM fosfato 50 mM pH 13 NaCl 100 mM fosfato 50 mM Curva estándar citosólica Uso que se haga previamente 0,15 M soluciones de la reserva de estabilización Compensar solución 0,15 M de KCl 15 ml de volumen final: 5 ml 0,15 M de solución tampón deseada + 10 ml 0,15 M KCl 10 mM de stock de nigericina en etanol, añadir 15 l de cada solución de volumen final pH 3 KCl 100 mM </td> glicina 50 mM nigericina 10? M pH 4 KCl 100 mM acetato 50 mM nigericina 10? M pH 5 KCl 100 mM acetato 50 mM nigericina 10? M pH 6 KCl 100 mM acetato 50 mM nigericina 10? M pH 7 KCl 100 mM Tris 50 mM nigericina 10? M pH 8 KCl 100 mM Tris 50 mM nigericina 10? M pH 9 KCl 100 mM Tris 50 mM nigericina 10? M pH 10 KCl 100 mM glicina 50 mM nigericina 10? M pH 11 KCl 100 mM fosfato 50 mM nigericina 10? M pH 12 </td> KCl 100 mM fosfato 50 mM nigericina 10? M pH 13 KCl 100 mM fosfato 50 mM nigericina 10? M pH todas las soluciones de calibración con HCl o NaOH Tabla 1: Composición de tampones. Esta tabla describe las composiciones apropiadas de los diferentes tampones utilizados en el protocolo. Archivo de código suplementario. Este archivo contiene una serie de macros, escrito por AP Levine, que son necesarios para el análisis de imágenes. Los autores serían felices para tratar de abordar las consultas asociadas con el uso de este código. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Una vez que los reactivos apropiados, ajustes del microscopio, y los experimentos de calibración se establecen, este método es relativamente simple de realizar. Los pasos críticos incluyen: el etiquetado de la Candida con S-1 para asegurar que no hay sobrecarga del tinte, la calibración y el análisis de la imagen.

S-1 es un reactivo adecuado para más entornos de pH alcalino, que es particularmente importante para los neutrófilos 21 pero limita su uso en ciertos tipos de células. Para entornos más ácidos, tales como los fagosomas de macrófagos, SNARF-4, o S-4, es más adecuado debido a su menor pKa 22. Por otra parte, para las lecturas citoplásmicos más precisos, es mejor utilizar S-4, como la curva estándar para S-1 muestra que las proporciones de fluorescencia comienzan a meseta por debajo de pH 6 (Figura 3). Otros colorantes, tales como 2' , 7'-bis- (2-carboxietil) -5- (y-6) carboxifluoresceína (BCECF) o pHrodo Red también pueden ser más adecuado en un context que se espera que sea ácida. Sin embargo, la tinción de citoplasma es todavía necesario para la correcta identificación de los fagosomas que contienen Candida.

Una característica importante de un indicador de pH phagosomal es que no se altera de manera irreversible por el entorno phagosomal reactiva. S-1 parece ser resistente al medio de neutrófilos. Esto se muestra por Levine et al. 5 (ver complementaria Video 4 de referencia 5) que demuestran la fagocitosis y la posterior liberación de una partícula Candida S-1 marcada por un Hvcn1 – / – de neutrófilos. Cuando fagocitados, la partícula se convierte de amarillo / naranja a rojo (pH neutro a alcalino), pero cuando la partícula es liberado por los neutrófilos, que vuelve a su color original.

Es importante mencionar algunas de las limitaciones asociadas con el uso de S-1. El hecho de que este colorante tiene dos espectros de emisión que permite meas ratiometricurement es una ventaja, pero se necesita equipo especializado para adquirir imágenes; El microscopio usado para los experimentos debe ser capaz de grabar dos imágenes simultáneamente o con un retardo de tiempo insignificante. Los autores suponen que el investigador de intentar este protocolo tiene experiencia en el uso de microscopía confocal, o tiene acceso a un profesional capacitado. No podemos enumerar todos los parámetros específicos del microscopio, ya que serán diferentes para cada microscopio y necesitan ser optimizados por el investigador. El éster de acetoximetilo conjugado con S-1 que permite que el tinte se difunda en el citoplasma celular se degrada por las esterasas no específicas en el citoplasma de la célula para formar la molécula fluorescente. Esterasas, tales como fosfatasa alcalina, están presentes en suero humano y suero bovino fetal, que se utilizan para complementar los medios de cultivo celular. En consecuencia, el medio en el que las células se cargan con S-1-AM (sección 4.5) no debe contener suero. Esto puede resultar difícil si el uso de células que requieren de un alimento-rich medio para sostener ellos que la solución de sal equilibrada utilizado a través de este protocolo. De manera similar, otros componentes del medio fluorescentes, tales como rojo de fenol, pueden interferir con las mediciones de S-1.

Las barras de error en la Figura 3 indican que existe alguna variación en las mediciones de la relación en cada pH. Un número adecuado de repeticiones de cada experimento (por lo menos n = 3) y se necesitan tantas mediciones individuales en cada experimento individual para superar la variación inter-vacuolar. Por tanto, es aconsejable para medir el pH de al menos 100 fagosomas para cada condición y como muchas áreas phagosomal que parecen contener sólo un Candida. Los fagosomas que han de medirse para la cuantificación debe ser los que han engullido completamente una partícula Candida (es decir, aquellos completamente rodeado por el citoplasma). Para mitigar los sesgos no intencionales en la selección de células / fagosomas Para la cuantificación, todos los análisis deben realizarse mientrasciego a las condiciones experimentales.

Aquí, se describe el aislamiento de los neutrófilos mediante sedimentación con dextrano de toda la sangre, seguido por centrifugación de la capa de plasma a través de un gradiente de densidad. Utilizamos esta técnica como forma rápida y eficiente produce una población pura (> 95%) de los neutrófilos, aunque hay otros métodos disponibles, como toda la centrifugación de la sangre a través de otras fórmulas de gradiente de densidad o de selección negativa de los neutrófilos utilizando kits especializadas con anticuerpos o magnéticos rosario. Sin embargo, este último puede ser prohibitivamente caro para la mayoría de los grupos que aislan neutrófilos de forma rutinaria. Además, usamos la heparina anticoagulante en el tubo para extracción de sangre, mientras que otros investigadores pueden ser más acostumbrados a usar ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o citrato de sodio de ácido (ACD). Como hay muchos métodos diferentes para elegir, que depende de la preferencia personal del investigador.

Además,cuando el aislamiento y la manipulación de los neutrófilos deben manejarse con cuidado para evitar la activación excesiva. pasos de precaución incluyen: sólo con artículos de plástico, no de vidrio; filtrar-esterilizar todos los tampones para eliminar cualquier endotoxina contaminante; Cuando los neutrófilos que hacen girar asegurarse de que la centrífuga está bien equilibrado para evitar vibraciones excesivas; limitar tanto como sea posible los neutrófilos tiempo permanecen en un sedimento después de la centrifugación; no mantienen neutrófilos en solución de más de 5 x 10 6 / ml; y llevar a cabo el experimento tan pronto como sea posible después del aislamiento.

Este método puede ser adaptado para medir los cambios en la zona de pH y phagosomal lo largo del tiempo mediante el uso de un conjunto etapa se calienta a 37 ° C en el microscopio y tomar instantáneas una vez cada 30-60 s desde la misma posición, como se describe para las etapas de calibración. Podría también teóricamente ser adaptado para experimentos de mayor rendimiento, tales como en placas de 96 pocillos, y para citometría de flujo experimentos, donde S-1 puedeser utilizado como un indicador de pH 23. Sin embargo, en esta configuración, el énfasis en la actividad de las células individuales se sustituye por un efecto más global sobre la población de células.

Este método tiene como objetivo proporcionar un relativamente simple montaje experimental en la que los investigadores individuales pueden adaptar para adaptarse a su área de interés. Los investigadores pueden querer explorar neutrófilos phagosomal pH y el área, mientras que también la medición de movimiento de otros iones, por ejemplo, la concentración de calcio intracelular. Hay varios fluorescentes de Ca2 + indicadores fácilmente disponibles para la microscopía confocal, como Indo-1, que también tiene espectros dual de emisión a 400 y 475 nm 24. Estas longitudes de onda de emisión no se superponen con S-1 espectros de emisión, pero la longitud de onda de excitación está en el extremo ultravioleta (UV) del espectro, que puede ser perjudicial para las células, y un láser de UV no es común en todos los microscopios. Una revisión exhaustiva de los diferentes indicadores demedir el flujo de calcio intracelular está cubierto por Takahashi et al. 25 y Hillson et al. 26.

En conclusión, hay otros métodos disponibles para medir el pH phagosomal utilizando diferentes colorantes fluorescentes como Nunes et al. han demostrado 13, así como otros grupos 27, 28. Otros investigadores también han utilizado S-1 para medir citosólica pH 29 o phagosomal pH 14. Sin embargo, este protocolo es único en medir simultáneamente el pH de ambos citosol y fagosoma, que proporciona la oportunidad de observar los cambios en phagosomal área de sección transversal y para distinguir entre tipo salvaje y Hvcn1 – / – neutrófilos de ratón, y los neutrófilos humanos con y sin una trabajando NADPH oxidasa.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue amablemente financiado por el Wellcome Trust, la Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación, y el Memorial Fellowship Irwin Joffe.

Materials

Candida albicans ATCC 10231 Vitroids  80 CFU Sigma-Aldrich RQC14003-10EA Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions
YPD broth Sigma-Aldrich Y1375 Follow manufacturer's instructions, various providers exist
Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000 MP Biomedicals 2101514 Use gloves 
Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000IU/ml  Fannin, Wockhardt UK Ltd FP1077 We purchased from UCH inpatient pharmacy
SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester – Special Packaging Thermo Scientific/Invitrogen SS22801 Use gloves
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Thermo Scientific/Invitrogen C1272 Use gloves
Vivaglobin human IgG  160mg/ml solution CSL Behring received as a gift Various providers exist
Normal mouse serum Abcam ab7486 Various providers exist
Lymphoprep (density gradient medium) Alere Ltd 1114547 Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque
Nigericin Sigma-Aldrich N7143 Toxic, use gloves, various providers exist
Saponin Sigma-Aldrich 47036 Toxic, use gloves, various providers exist
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Toxic, use gloves, various providers exist
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375 Various providers exist
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma-Aldrich T1503  Various providers exist
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333 Various providers exist
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 Various providers exist
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266 Various providers exist
Magnesium sulphate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506 Various providers exist
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Various providers exist
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C1016 Various providers exist
Glucose Sigma-Aldrich D9434 Various providers exist
Absolute Ethanol  Sigma-Aldrich 2860 Various providers exist
Diphenylene iodonium (DPI) Sigma-Aldrich D2926 Various providers exist
Zinc chloride Sigma-Aldrich 208086 Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate
Poly L lysine Sigma P4707 Various providers exist
Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700) Carl Zeiss The microscope must be able to excite at 555nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600nm, >610nm)
Ibidi µ slide 8 well ibiTreat Thistle Scientific IB-80826 Other appropriate imaging dishes can be substituted
Fluorodish Cell Culture Dish-35mm, 23mm well World Precision Instruments  FD35-100 Other appropriate imaging dishes can be substituted, different sizes are available
Soniprep 150 MSE Any appropriate sonicator will suffice
TC20 Automated Cell Counter BioRad Various providers exist
1.5ml Protein LoBind Tubes Sigma-Aldrich Z666505-100EA Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs
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Foote, J. R., Levine, A. P., Behe, P., Duchen, M. R., Segal, A. W. Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator. J. Vis. Exp. (122), e55107, doi:10.3791/55107 (2017).
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