Bu protokol, sitokin-benzeri faktör-1 (CLF-1 arasındaki etkileşimi ile nakledildiği Silier Nörotrofik Faktör Reseptör-a (CNTFRα), infekte göstermek için nasıl kullanılabileceğini Western lekeleme ve lizozomal enzim inhibisyonu ile birlikte immünositokimya tarif ) ve endositik reseptör sorLA.
heterodimerik sitokin Kardiyotropin gibi sitokin: Sitokin benzeri Faktör-1 (CLC: CLF-1) (glikozil (GPI) daha sonra 130 / Lösemi İnhibitör Faktörü Reseptör-p glikoprotein erler bir trimerik kompleksi oluşturmak üzere CNTFRα -anchored hedef gp130 / sinyali için LIFRβ). CLC ve CNTFRα iki sinyal ancak bugüne kadar CLF-1'in sadece CLC salgılanması farazi bir kolaylaştırıcı olarak bilinmektedir için gereklidir. Bununla birlikte, son zamanlarda CLF 1, üç bağlama bölgesine içerdiği gösterilmiştir: CLC için on; CNTFRα için bir (bu trimerik kompleksinin montaj teşvik edebilir); ve endositik reseptörü sorLA için. CLF-1, hem de trimerik (CLC: CLF 1: CNTFRα) ikinci Alanı CLF-1, CLC yüksek bağlanma eğilimi sağlayan sorLA kompleksin, ve hücreler çözülebilir ligandlan CLF-1 ve CLC sorLA salgılayan : CLF-1 hızla alınır ve içselleştirilmiş olan. CNTFRα ve sorLA birlikte ifade eden hücrelerde, CNTFRα ilk CLC bağlanır: CLF 1 oluşturulması içinmembrana bağlı trimerik kompleksi, ama aynı zamanda CLF-1 serbest sorLA bağlanma sitesi aracılığı ile sorLA bağlanır. Bunun bir sonucu olarak, kendi başına endositoz için yer bulunmamaktadır CNTFRα, birlikte asıldı ve CLC sorLA dolayımlı endositoz tarafından içselleştirilir: CLF-1.
Mevcut protokol) sorLA aracılı ve CLC i göstermek için kullanılan deneysel prosedürleri açıklar: Yüzey membran CNTFRα ifade CLF-1-bağımlı infekte; ii) endositoz ve CNTFRα hedefleme lızozomal sorLA aracılı; ve iii) CLC indirdi hücresel yanıt: CNTFRα of sorLA aracılı baskılanması üzerine CLF-1-stimülasyon.
CLF-1: 1-3 CLC ve CLF-1 heterodimerik sitokin CLC iki alt oluşturmaktadır. hücresel sinyal indüksiyonu için CLC: CLF-1 ilk defa hedef CNTFRα, birincil ve GPI bağlantılı alıcı, bir zara-bağlı trimerik kompleksi oluşturmak üzere. CLC: CLF 1: CNTFRα kompleksi, daha sonra acemi transmembran Janus Kinaz / Sinyal transformatörleri ve transkripsiyon 3 (JAK / STAT3) yolunun 4 aktifleştiriciler ile sinyal aracılık gp130 / LIFRβ. Üç alt birimlerin herhangi bir eksik farelerde bir ekran ve aynı fenotipe nedeniyle yüz nöronlar ve yetersiz emme 5-8 sayısı azaltılmış doğumdan sonraki 24 saat içinde ölür. İnsanlarda bulgular aynı şekilde üç alt birimden işlevsel tutarlılığını vurgulamaktadır. Bu nedenle, insan mutasyon (homozigot ya da bileşik) CLC neden bozukluğu: CLF-1 ya da CNTFRα adlandırılan soğuk bağlı terleme / Crisponi sendromu tüm sonuç, örneğin impai gibi semptomlarla karakterize bir durumunKırmızı emme ve yutma, çeşitli dismorfik özellikleri, sıcaklık yükselmeleri ve paradoksal ve düşük sıcaklıklarda 9-11 terleme serpmek.
İn vitro olarak, CLC ve CNTFRα kombinasyonu gerekli ve gp130 / LIFRβ ile etkileşim ve hücreler 12 sinyal uyarılması için yeterli hem de. Öte yandan CLF-1 rolü daha az açıktır. Doğrudan sinyal dahil değildir ve özellikle uzun CLC 1'in selüler salgılanmasını kolaylaştırmak için hizmet eden bir ek olarak kabul edilmiştir. Ancak, yeni bulgular CLF-1 sinyalizasyon ve CLC ve CNTFRα ciro hem karıştığı ek ve daha önemli fonksiyonları olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, CLF 1 üç bağımsız bağlayıcı bölge içeren görünür: bir tane onun CLC bağlanabilen bilinen; CNTFRα doğrudan bağlanma aracılık on; ve endositik reseptörü sorLA ile etkileşim için üçüncü (yüksek afinite) alan. CLC ve CLF-1 hem de görünüyor & # olarak160; CLC daha çok daha düşük bir afinite ile CNTFRα hedef: CLF-1 kompleksi (ve buna CNTFRα bağlanma bölgesi ile) CLF 1 CLC ve CNTFRα birleşmesini teşvik eder ve bu şekilde 13 sinyal kolaylaştırdığı düşünülebilir.
sorLA ile CLF-1'in etkileşim, mevcut sunumun ana sorunu, tamamen farklı bir rol oynar. SorLA Vps10p alan reseptör ailesine 14 oluşturan beş tip 1 reseptör biridir. Bu çeşitli dokularda değil, beyin ve sinir doku 15, özellikle de ifade edilir. Diğer aile üyeleri benzer sorLA Vps10p-bağlama alanı, bir N-terminal ligand taşıyan, fakat ek olarak, aynı zamanda, düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör ailesinin 15 üyelerinde bulunan ligand bağlama elemanları da dahil olmak üzere diğer alan türleri içerir. Sitoplazmik kuyruk çok bağdaştırıcı proteinleri, örneğin, adaptör protein-1 ve -2 ve sorLA etkileşim etkin endocytos taşırolduğu gibi bağlı proteinlerin 16-18 hücre içi sıralama ve ulaşım. Vps10p-etki CLF-1 (ama özellikle, CLC değil) 13 dahil ilgisiz ligandlar bir dizi bağlayan büyük bir on-bıçaklı β-pervane 19,20 içerir. CLF-1 bağlama sahası erişilebilir sonra bile sorLA sadece bağlanan demektir CLC ve CNTFRα ile kompleks oluşumu serbest CLF-1, aynı zamanda CLC: CLF-1 ve trimerik kompleks CLC: CLF 1: CNTFRα 13. SorLA CLF-1 ve CLC hızlı endositoz taşır: CLF-1, ama CNTFRα bir GPI-eki yüzey membrana sabit ise, bu çözünür proteinler bulunmaktadır. / Ve CLF-1:: CNTFRα sorLA tüm karmaşık içselleştirmesi için izin verir ve böylece CNTFRα yüzey membran ifade (CLF-1 sinyal indüksiyon ve CLC sonra hücresel duyarlılık) değiştirmek için soru CLC nedenle eğer bağlayıcıdır veya CNTFRα cirosu.
Bu tarif edilen deneylerRaporda aşağıdaki soruları açıklığa kavuşturmak için dizayn edilmiştir:
sorLA CLC arabuluculuk mu: Yüzey-membran CNTFRα CLF-1-bağımlı downregülasyonun? Bu açıklığa kavuşturmak için, ilk olarak, 21 de tarif edildiği gibi metabolik etiketleme ve darbe kovalayıcı deneyler vasıtasıyla (ve yokluğunda sorLA varlığında) CNTFRα ciro belirlenmeye çalışılmıştır. Bununla birlikte, CNTFRα [S 35] sistein bir karışımının ve [S 35] metionin radyoaktivite zayıf birleşme gösterdi etiket çalışır. Bu büyük olasılıkla reseptörlerinin ani ve önemli kaybını telafi etmek mümkün olacağını yeni sentez çok düşük derecede önerdi. CLC aracılığıyla birbirine zaman CNTFRα downregüle olup olmadığını belirlemek için: CLF-1 sorLA nedeniyle, bu nedenle sadece öncesi ve CLC maruz kaldıktan sonra (Batı blot kullanarak) CNTFRα toplam hücresel havuzu ölçmek için karar verildi: CLF-1 – ve sonuçları karşılaştırmak için hücreler transfekte edilmiş veya transfekte edilmiş değilsorLA.
sorLA lızozomlara CNTFRα hedef mu? Bu soruyu, CNTFRα lokalizasyonu cevaplamak için – kendi CLC yoluyla içselleştirilmiş: sorLA bağlanmasını CLF-1 aracılı – immünsitokimya kullanılarak incelenmiştir ve CNTFRα yönelik antikorlar ve geç endosome / lizozom işaretleyici Lizozomal ilişkili Membran Protein 1 ile etiketleme (LAMP-1). Deney lizozomal enzimlerin inhibitörleri ile tedavi edilmemiş hem de tedavi edilen hücreler üzerinde gerçekleştirilmiştir. fikri CNTFRα lizozomlarda bozulmuş olup olmadığını muamele edilmemiş hücreler CNTFRα için çok az veya hiç leke bırakmazlar olur ise, enzim inhibitörleri ile tedavi edilen hücreler, lamba-1 pozitif veziküllerinde biriken CNTFRα lekelenmeyi mevcut olacağını tabii ki.
CLF-1 stimülasyonu: CNTFRα downregülasyonun CLC hücresel cevabı düşürmek mu? JAK / STAT3 kullanılarak gp130 / LIFRβ heterodimeri ile CLC, CLF-1 ve CNTFRα sinyallerinin oluşan trimerik kompleksipatika. Buna göre, hücrelerin kapasitesi CLC cevap: CNTFRα baskılanması üzerine CLF-1 sinyal Western Blot algılama ve sorLA transfektanlarında fosfo-STAT3 (pSTAT3) / toplam STAT3 seviyesinin ölçülmesi tarafından araştırılmıştır.
Burada açıklanan protokol sorLA aracılı CLC göstermek için özel olarak kullanılabilir: CLF-1 bağımlı baskılanması ve CNTFRα hedeflenmesi lızozomal yanı sıra CLC eşlik eden zayıflatılmış karşılık: CLF-1 stimülasyonu.
Onlar, CNTFRα ve sorLA sadece küçük bir endojen ifade var ekspres gp130 / LIFRβ, transferinde kolay ve immünsitokimya uygundur büyük bir hücre gövdesi, sahip olduğu HEK293 hücre hattı, bu protokol için çok uygundur. Ancak, teorik olarak benzer özelliklere sahip herhangi bir hücre hattı da çalışır.
protokol iki kritik adımlar vardır. Birincisi leu / PEP ortamı 24 saat boyunca, yaklaşık her 6 saatte bir değiştirilmelidir ki 2.3, aşama. Aksi takdirde, aktif lizozomal enzimleri ve daha az veya lizozomlar protein tespit edilebilir bir birikmesine neden olabilir. ikinci kritik aşama (3.4) CLC ile ön kuluçkaya yatırıldıktan sonra da yıkama ilgilidir: CLF-1. Bu imnem li bağlanmamış ligandı çıkarmak için, ve hücreler zaman katkısız DMEM (boş ortam) (devamı stimülasyonu kaçınarak) kurtarmak için izin vermek. CLF-1 (adım 3.5): Bu CLC ile müteakip tekrar uyarma sırasında pSTAT3 düşük arka plan düzeyi sağlayacaktır.
Özellikle, Şekil 6, hücresel yanıtı (pSTAT3) CNTFRα bölgesinin sorLA aracılı baskılanması paralel olarak azaldığı gösterilmiştir. Azaltılmış tepki CNTFRα havuzun bir azalma (ve üzerine beklenen) uyarınca olmasına rağmen, düşük CNTFRα ifade tek başına azalmış hücresel yanıt hesapları olduğunu ispat olmadığını, ancak vurgulanmalıdır. Böylece, bu değişiklikler – Ön stimülasyon veya transfeksiyon kaynaklanan – akış yukarı pSTAT3 için sinyal yolunun işlevsel elemanlarının bir değişmiş yanıta katkıda bulunmuş olabilir.
protokol temel kavramı bu particu sınırlı değildirlar reseptör sistemi. (. Örneğin, bir başka hücre hattı, diğer antikorlar ile, başka ligandlar, vs.) – bağımsız sorLA's tutulum protokolünü değiştirerek bunun yanı sıra, diğer reseptörlere ligand bağlı infekte belirlemek için kullanılabilir. Ancak, Western blotting ile reseptör baskılanması analizi esas olarak örneğin, reseptör, yavaş ciro ve uyarılmamış hücrelerde yeni sentez düşük derecesi sergilerler ve GPI-ankorlu reseptörleri için uygun olduğunu belirtmek gerekir. Bu nedenle, yeni sentez yüksek seviyede gösteren reseptörleri, ligand-bağlı baskılanması yeni reseptörler sentezi ile telafi edilebilir. 21 'de tanımlanan, bu koşullar altında, reseptör havuz baskılanması yerine metabolik etiketleme ve darbe kovalayıcı deneyler ile belirlenebilir. Seçenek olarak ise, reseptör ile karışmaz iyotlanmış antikorlar (tercihen Fc fragmanları) "etiket" RECEPT ekto için kullanılabilir bağlanmaya ve beklenen baskılanması daha sonra hücre peleti ve ortamın radyoaktif sayımı ile tespit edilebilir.
Lojistik nedenlerle bir CNTFRα ile hücreleri myc-etiketi taşıyan yapı transfekte ve mevcut protokol, bir fare anti-myc antikoru reseptörün Western blot algılama için kullanılmıştır. Bunun aksine, bir keçi anti-CNTFRα antikoru LAMP-1, bir fare antikoru ile tespit edildiği gibi, bağışıklık kimyası ve çift etiketleme için kullanıldı – ve tabii ki sekonder antikor ile spesifik olmayan (çakışan) boyama neden olur, iki primer fare antikorları kullanır. keçi anti-CNTFRα aynı zamanda (gösterilmemiş olan) Western blotlama çalışır, çünkü protokolü kolaylıkla değiştirilebilir ve etiketsiz CNTFRα ile transfekte edilmiş hücrelerin de uygulanabilir olduğunu not edin.
Yüksek afiniteli 22 CLF-1: Son olarak, son zamanlarda, aynı zamanda endositik reseptör sortilin CLC bağlandığı gösterilmiştir. Bu nedenle, bu akla bu sortilin gibi olduğusorLA CLC için ara bağlantılar: CLF-1 ile CNTFRα endositoz ve de CNTFRα hedefleme lızozomal aracılık edebilir. yerine sorLA ve sortilin kullanarak, mevcut protokol bu soruyu netleştirmek için kullanılabilir.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
Dulbecco Modified Eagle´s Medium | Lonza | BE12-604F/U1 | |
Fetal bovine serum | Thermo Scientific | 10270106 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
Dulbecco Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30028.02 | |
CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
LDS sample Buffer (4X) | Novex | NP0007 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
4% paraformaldehyde | VWR | 97,135,000 | |
Saponin | Sigma | S7900-100G | |
Mounting Media | Dako | S3023 |