SorLA CLC: Western Blot, lizozomal enzimlerin inhibisyonu ve immunositokimya ile gösterildiği gibi CNTFRα CLF-1 bağımlı baskılanması

CNTFRα Lisatlar 1. Western Blot Tam uzunlukta sorLA ve myc-etiketli CNTFRα insan embriyonik böbrek yapıları ifade pcDNA3.1 / Zeo kullanılarak 293 (HEK293) hücreleri (-) ve pcDNA3.1 / hyg (-), sırasıyla. konstruktları imalatçının protokolüne göre, ticari bir transfeksiyon reaktifi kullanılarak HEK293 hücrelerinin transfeksiyonu. 150 ug / ml Zeosin ve / ya da 500 ug / ml Higromisin B Gold 13 ihtiva eden ortam içinde kararlı klonlar seçilebilir. HEK293 Tohum eşit sayıda eksprese eden CNTFRα-myc ve transfektanları birlikte ifade Eagle's Ortamı (DMEM) Modifiye Dulbecco hücreleri,% 10 fetal ile takviye Şekil 1. Kültür gösterildiği gibi, iki 4-yuvalı plakalar içinde CNTFRα-myc / sorLA sığır serumu (FBS), 100 U / ml penisilin ve 37 ° C'de bir% 5 karbon dioksit kuluçka makinesi içinde 100 ug / ml streptomisin (tam ortam). % 80 birleşen – hücreleri 50 kadar bekleyin. orta çıkarınWells, Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile bir kez yıkanır ve ya da (kontrol), 10 nM CLC olmayan, taze tam ortam ekleyin: CLF-1, Şekil 1 'de gösterildiği gibi. 37 ° C'de inkübe hücreleri. inkübasyondan 0 ve 5 saat sonra ortam yeniden elde etmek ve 1.5 ml tüpler içinde 4 ° C'de saklayın. Daha sonra her bir oyuğa proteinaz inhibitör kokteyli (1 dakika, 4 ° C) ile takviye edilmiş,% 1 Triton X-100 lizis tamponu (20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0) ilave edilir. Daha sonra, 1.5 ml tüpler (4 ° C) hücre lizatları aktarın. orta ve hücre lizatı (3000 xg, 3 dakika, 4 ˚C) içeren tüpler Spin ve 1.5 mL tüpler (4 ˚C) süpernatantlar aktarın. pelet atın. Yeni 1.5 mL tüpler her hücre lisatı süpernatant transferi 5 uL – daha sonra protein içeriğini ölçmek için bunları kullanmak (1.7 adım). Hemen tüm süpernatanlanna indirgeyici olmayan LDS numune tampon ekleyin ve örnekleri girdap. Prot ölçmek için 5 uL'lik kullanınimalatçının protokolüne göre, ticari bir protein deneyini kullanarak hücre lisatı süpernatanlarında ein içeriği. 5 dakika boyunca 95 ° C'de numune ısıtın. (5 13 lekeleme SDS-PAGE 13 azaltma ve Western her numune proteinin eşit tutar, ve anti-sorLA 16 tavşan kullanılarak ortam içinde ve hücre lizatları içinde sorLA, β-aktin ve CNTFRα-Myc içeriğini görselleştirmek ug / ml), fare anti-β-aktin (0.4 ug / mL) ve fare anti-myc (1 ug / ml) antikorlar ve uygun HRP-bağlı sekonder antikor (1: 2000). üreticinin protokolüne uygun olarak yoğunluk ile bantlar sayısal olarak. Lizozomal inhibitörleri ile kombinasyon halinde 2. İmmünositokimya Şekil 2'de gösterildiği gibi tohum HEK293 hücreleri, bir 4-plaka kapaklı lam üzerinde CNTFRα-myc / sorLA ile transfekte edildi. Kültür, yukarıda tam ortam içinde hücreler. % 40 – hücre izdiham 20 kadar bekleyin. Kuyulardan Ortamı çıkarın ve Şekil 2'de gösterildiği gibi olan veya leupeptin, 50 ug / mL olmayan ve hücrelere pepstatin A (Leu / PEP) (inhibe lizozomal hidrolazlar) tam orta ekleyin. 37 ° C'de inkübe hücreleri. Orta inkübasyon takip eden 24 saat boyunca her 6 saatte bir değiştirilmelidir. inkübasyon 24 saat sonra, bir kez daha (ley / moral ile veya olmadan) orta yerine ve bu kez 10 nM CLC ekleyin: CLF-1. 5 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri. PBS içinde bir kez hücreler yıkanır ve oda sıcaklığında 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid, pH 7 içinde tespit edin. Dikkat: Paraformaldehyde Deri, göz ve mukoza ile temasından kaçının, son derece toksiktir. Eldiven ve koruyucu gözlük yıpranmış ve çözüm davlumbaz içine yapılmalıdır. PBS içinde bir kez hücreler yıkanır ve PBS içinde seyreltilmiş saponin içinde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (% 0,5 saponin) hücreleri geçirgenliği. keçi anti-CNTFRα seyreltilir (1 ug / mL) (özellikleolmayan fare anti-myc,% 0.5 saponin içinde Western blotting) ve fare anti-LAMP-1 (15 ug / ml) antikorlar kullanılabilir ve oda sıcaklığında 2 saat için antikorların hücreler inkübe edin. % 0.5 saponin hücreler 4X (5 dakika) yıkanır ve eşek anti-keçi Alexa 488- ve eşek anti-fare Alexa 568-konjuge sekonder antikor (6 ug / ml), oda sıcaklığında 2 saat boyunca kuluçkaya bırakılır. iki kez iyonu giderilmiş su (1 dakika),% 0.5 saponin hücreler 4X (5 dakika) yıkanır, montaj ortamı kullanılarak mikroskop lamları üzerinde kapağı montaj slaydları. 63X Cı-Apochromat suya daldırma objektif, NA 1.2 olan bir lazer konfokal tarama mikroskobu kullanılarak konfokal mikroskobu ile hücrelerin antikor lekelemesi analiz edin. pSTAT3 Seviye 3. Western Blot algılama Şekil 3'te gösterildiği gibi, 4-plaka (CNTFRα endojen seviyelerini ifade) Tohum HEK293-sorLA hücreleri. Kültür, yukarıda tam ortam içinde hücreler. kadar bekleyin% 80 birleşen – hücreleri 50 vardır. Kuyulardan orta çıkarın PBS içinde bir kez yıkayın ve nM CLC veya 10 olmayan, taze tam ortam ekleyin: CLF-1 hücreleri, Şekil 3'te gösterildiği gibi. 5 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri. , Orta çıkarın katkısız DMEM hücreler iki kez yıkayın (boş ortam, FBS ve antibiyotiksiz) ve boş bir ortam içinde 90 dakika boyunca (37 ° C) hücreler reincubate. Şekil 3'te gösterildiği gibi (STAT3 fosforilasyonunu başlatmak için) CLF-1: Bir kez daha, orta kaldırmak ile ya da 5 nM CLC olmayan taze bir boş ortam ekleyin. 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Hızlı bir şekilde (1 dakika, 4 ° C) proteinaz inhibitör kokteyli ve fosfataz inhibitörü ile takviye edilmiş,% 1 Triton X-100 lizis tamponu (20 mM Tris-HCI, 10 mM EDTA, pH 8.0) eklenerek hücreler orta kaldırmak ve lize her kuyuya kokteyl. Daha sonra, 1.5 ml tüpler (4 ° C) hücre lizatları aktarın. Transferi 5 uL of yeni 1.5 ml tüpler her süpernatant – (3.8 adım) daha sonra protein içeriğini ölçmek için kullanabilirsiniz. Hemen tüm süpernatanlanna indirgeyici olmayan LDS numune tampon ekleyin ve örnekleri girdap. imalatçının protokolüne göre, ticari bir protein deneyini kullanarak 5 uL alikot protein içeriğini ölçmek. artık yapışkan (yaklaşık 1 dakika) ve daha sonra 5 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtmak kadar oda sıcaklığında her bir örnek sonikasyon. SDS-PAGE ve Batı 13 13 kurutma, her numunenin protein eşit tutar, ve tavşan anti-pSTAT3 (1: 2000) kullanılarak hücre lizatları içinde pSTAT3 içeriğini toplam STAT3 görselleştirmek, anti-STAT3 ve fare (1: 1000 ) antikorları ve uygun HRP-bağlı fare ve tavşan sekonder antikor (1: 2000). üreticinin protokolüne uygun olarak yoğunluk ile bantlar sayısal olarak.