Dieses Protokoll beschreibt, wie Western-Blotting und Immunzytochemie mit der Hemmung der lysosomalen Enzymen in Kombination verwendet werden, können die Herunterregulierung von Ciliary Neurotrophic Factor Receptor-α (CNTFR & agr;) zu demonstrieren, die durch die Wechselwirkung zwischen Cytokine-like factor-1 (CLF-1 gefördert wird, ) und der endozytotischen Rezeptors sorLA.
Das heterodimere Cytokin Cardiotrophin-like Cytokine: Zytokin-like factor-1 (CLC: CLF-1) zielt die Glycosylphosphatidylinositol (GPI) CNTFR & agr; -verankertes eine trimere Komplex zu bilden, der anschließend rekrutiert gp130 / Leukemia Inhibitory Factor Receptor-β (gp130 / LIFR & beta;) für Signalisierung. Sowohl CNTFR & agr; CLC und sind notwendig für die Signalisierung aber bisher CLF-1 wurde nur als putative Facilitator von CLC Sekretion bekannt. Es hat sich jedoch kürzlich gezeigt worden, dass CLF-1 enthält drei Bindungsstellen: eine für CLC; eine für CNTFR & agr; (dass die Montage des trimeren Komplexes fördern kann); und eine für den endozytischen Rezeptor sorLA. Die letztere Seite bietet eine hochaffine Bindung von CLF-1, CLC: CLF-1, sowie die trimere (CLC: CLF-1: CNTFR & agr;) -Komplex zu sorLA und in sorLA-exprimierenden Zellen, die löslichen Liganden CLF-1 und CLC : CLF-1 werden schnell aufgenommen und verinnerlicht. In Zellen CNTFR & agr; und sorLA co-exprimierenden, CNTFR & agr; bindet ersten CLC: CLF-1 zu bilden,ein membranassoziiertes trimere Komplex, aber auch eine Verbindung über die freie sorLA-Bindungsstelle in CLF-1 bis sorLA. Als Ergebnis CNTFR & agr;, die von sich aus keinen Platz für die Endozytose aufweist, zog entlang und durch die sorLA-vermittelte Endozytose internalisiert CLC: CLF-1.
Das vorliegende Protokoll beschreibt die experimentellen Verfahren verwendet i zu demonstrieren) die sorLA-vermittelte und CLC: CLF-1-abhängige Herunterregulieren der Oberflächenmembran CNTFR & agr; Ausdruck; ii) sorLA vermittelte Endozytose und lysosomalen von CNTFR & agr; ausgerichtet sind; und iii) die abgesenkte zelluläre Antwort auf CLC: CLF-1-Stimulation auf sorLA vermittelte Herunterregulieren der CNTFR & agr;.
Die CLC und CLF-1 bilden die beiden Untereinheiten des heterodimeren Cytokins CLC: CLF-Januar 1-3. Für zellulären Signal Induktion, CLC: CLF-1 erste Ziele der CNTFR & agr;, ihren primären und GPI-Anker-Rezeptor, ein membrangebundenes trimere Komplex zu bilden. Die CLC: CLF-1: CNTFR & agr; Komplex anschließend rekrutiert gp130 / LIFR & beta; die Trans über die Janus – Kinase / Signalgeber und Aktivatoren der Transkription 3 (JAK / STAT3) -Weg 4 Signalisierung vermittelt. Mäuse defizient in einer der drei Untereinheiten zeigen ein und denselben Phänotyp und sterben innerhalb von 24 h nach der Geburt aufgrund einer reduzierten Anzahl von Gesichts Neuronen und unzureichende Säugen 5-8. Befunde beim Menschen ebenfalls unterstreichen den funktionalen Zusammenhang der drei Untereinheiten. So menschliche Mutationen (homozygot oder Verbindung) verursacht Dysfunktion von CLC: CLF-1 oder CNTFR & agr;, alle Ergebnis in der sogenannten kälteinduzierten Schwitzen / Crisponi-Syndrom, einer durch Symptome wie impai gekennzeichnet istrot Säugen und Schlucken, verschiedene Dysmorphiezeichen, Temperaturspitzen und paradox und perfuse bei niedrigen Temperaturen 9-11 Schwitzen.
In vitro ist die Kombination von CLC und CNTFR & agr; sowohl notwendig als auch ausreichend für die Interaktion mit gp130 / LIFR & beta; und der Induktion von Signalisierungs in Zellen 12. Die Rolle der CLF-1 auf der anderen Seite ist weniger klar. Es ist nicht direkt in Signalgebung beteiligt, und ist seit langem als Anhang angesehen worden , die hauptsächlich die zelluläre Sekretion von CLC 1 zu erleichtern , dient. jüngsten Ergebnisse zeigen jedoch, dass CLF-1 hat zusätzliche und wichtige Funktionen Verwicklung sowohl die Signalisierung und einem Umsatz von CLC und CNTFR & agr;. So scheint es, dass CLF-1 drei unabhängigen Bindungsstellen enthält: eine für seine gut bekannt CLC binden; eine, die auf die CNTFR & agr; die direkte Bindung vermittelt; und eine dritte (hohe Affinität) -Stelle für die Wechselwirkung mit dem Rezeptor endocytic sorLA. Da beide CLC und CLF-1 scheinen & #160; CNTFR & agr; mit einem beträchtlichen niedrigeren Affinität als die CLC Ziel: CLF-1 – Komplex, ist es denkbar , dass CLF-1 (über seine CNTFR & agr;-Bindungsstelle) , die Vereinigung und CNTFR & agr; CLC fördert und erleichtert dadurch 13 signalisiert.
CLF-1-Interaktion mit sorLA, das Hauptproblem der vorliegenden Präsentation, spielt eine ganz andere Rolle. SorLA ist eine der fünf Typ – 1 – Rezeptoren, die die Vps10p-Domäne – Rezeptor – Familie 14 bilden. Es wird in einer Vielzahl von Geweben exprimiert , aber insbesondere in Gehirn- und neuronalen Geweben 15. Ähnlich wie bei den anderen Familienmitgliedern sorLA trägt einen N-terminalen Liganden Vps10p-Bindungsdomäne, sondern darüber hinaus umfasst es auch andere Domain – Typen einschließlich Ligand-bindenden Elemente in Mitglieder des Low-Density – Lipoprotein – Rezeptor – Familie 15 gefunden. Ihre zytoplasmatischen Schwanz interagiert mit mehreren Adapterproteine, beispielsweise Adaptor – Protein-1 und -2 und sorLA vermittelt effiziente endocytosist sowie intrazelluläre Sortierung und Transport von gebundenen Proteine 16-18. Die Vps10p-Domäne umfasst eine große zehn beschaufelten β-Propeller 19,20, die eine Reihe von nicht verwandten Liganden einschließlich CLF-1 bindet (aber insbesondere nicht CLC) 13. Die Bindungsstelle in CLF-1 ist zugänglich , auch nach der Komplexbildung mit CLC und CNTFR & agr; das bedeutet , dass sorLA nicht nur frei CLF-1 bindet, aber auch CLC: CLF-1 und die trimere Komplex CLC: CLF-1: CNTFR & agr; 13. SorLA vermittelt rasche Endocytose von CLF-1 und CLC: CLF-1, aber diese sind lösliche Proteine während CNTFR & agr; an die Oberflächenmembran durch einen GPI-Anker befestigt ist. Die Frage ist daher, ob die Bindung von CLC: CLF-1: CNTFR & agr; sorLA ermöglicht den gesamten Komplex zu internalisieren und dadurch die Oberflächenmembran-Expression von CNTFR & agr; (und die nachfolgende zelluläre Anfälligkeit für CLC: CLF-1-Signal Induktion) zu verändern und / oder der Umsatz von CNTFR & agr;.
Die Experimente in der Gegenwart beschriebenBericht wurden entwickelt, um die folgenden Fragen zu klären:
Hat sorLA CLC vermitteln: CLF-1-abhängige Herunterregulieren der Oberflächenmembran CNTFR & agr;? Um dies zu verdeutlichen, wurde sie zunächst versucht , den Umsatz von CNTFR & agr; (in der Abwesenheit und Anwesenheit von sorLA) mittels metabolischer Markierung und Puls-Chase – Experimente , um zu bestimmen , wie in 21 beschrieben. Jedoch versucht CNTFR & agr; unter Verwendung einer Mischung von [S 35] Cystein und [S35] Methionin zeigten schlechte Inkorporation von Radioaktivität zu etikettieren. Dies legte nahe, einen sehr niedrigen Grad der new-Synthese, die aller Wahrscheinlichkeit nach nicht in der Lage sein würde, für einen plötzlichen und erheblichen Verlust von Rezeptoren zu kompensieren. Um festzustellen, ob CNTFR & agr; nach unten reguliert wurde, wenn über CLC miteinander verbunden sind: CLF-1 bis sorLA, es wurde daher beschlossen, einfach zu messen (unter Verwendung von Western-Blot), um den gesamten zellulären Pool von CNTFR & agr; vor und nach der Exposition gegenüber CLC: CLF-1 – und vergleichen Sie die Ergebnisse in Zellen transfiziert oder nicht transfiziert mitsorLA.
Hat sorLA CNTFR & agr; zu Lysosomen Ziel? Um diese Frage zu beantworten, die Lokalisierung von CNTFR & agr; – über seine CLC verinnerlicht: CLF-1-vermittelten sorLA Bindung – wurde mit Immunzytochemie untersucht, und die Kennzeichnung mit Antikörpern gegen CNTFR & agr; und der spät Endosomen / Lysosomen Marker lysosomale-assoziierten Membrane Protein 1 (LAMP-1). Das Experiment wurde an Zellen durchgeführt, sowie unbehandeltem mit Inhibitoren von lysosomalen Enzymen behandelt. Die Idee war natürlich, dass, wenn CNTFR & agr; in Lysosomen abgebaut wurde, mit Enzym-Inhibitoren behandelten Zellen würden CNTFR & agr;-Färbung der sich in den LAMP-1-positive Vesikel präsentieren, während unbehandelte Zellen wenig oder keine Färbung für CNTFR & agr; zeigen würde.
CLF-1-Stimulation: Hat CNTFR & agr; Herabregulation der zellulären Antwort auf CLC senken? Der trimere Komplex, bestehend aus CLC, CLF-1 und CNTFR & agr; Signale über den gp130 / LIFR & beta; Heterodimer die JAK / STAT3 mitWeg. Entsprechend reagieren die Fähigkeit der Zellen zu CLC: CLF-1-Signalisierung auf Herabregulation von CNTFR & agr; durch Western-Blot-Nachweis und die Quantifizierung des phospho-STAT3 (pSTAT3) / Gesamt STAT3 Ebene in sorLA Transfektanten erforscht.
CLF-1-abhängige Herabregulation und CNTFR & agr; Targeting lysosomalen sowie die begleitende geschwächt Reaktion auf CLC: Das hier beschriebene Protokoll kann spezifisch das sorLA vermittelte CLC zu demonstrieren verwendet CLF-1 Stimulation.
Die HEK293-Zelllinie ist gut geeignet für dieses Protokoll, da sie nur eine geringe endogene Expression von CNTFR & agr; und sorLA haben, sind einfach zu transfizieren, Express gp130 / LIFR & beta; und haben einen großen Zellkörper, die für die Immunzytochemie geeignet ist. Jedoch kann jede Zelllinie mit ähnlichen Eigenschaften in der Theorie sollte auch funktionieren.
Das Protokoll hat zwei wichtige Schritte. Die erste betrifft Schritt 2.3, bei dem die leu / pep Medium muß ca. alle 6 Stunden für 24 h ersetzt. Geschieht dies nicht, so kann es zu aktiven lysosomale Enzyme und weniger oder keine nachweisbare Anreicherung von Protein in den Lysosomen. Der zweite kritische Schritt (3.4) Bedenken bei Vorinkubation mit CLC Waschen: CLF-1. Es ist imwichtige jeglichen ungebundenen Liganden zu entfernen, und die Zellen Zeit, sich zu erholen (Fortsetzung Stimulation vermieden wird) in nicht ergänztem DMEM (blank Medium). CLF-1 (Schritt 3.5): Dies wird eine geringe Hintergrundpegel von pSTAT3 während der anschließenden Wieder Stimulation mit CLC gewährleisten.
Bemerkenswert ist , Abbildung 6 zeigt , dass die zelluläre Antwort (pSTAT3) nimmt parallel mit der sorLA vermittelte Herunterregulieren der CNTFR & agr;. Es sollte jedoch betont werden, dass, obwohl eine verminderte Antwort gemäß ist mit (und voraussichtlich auf sein) eine Reduzierung des CNTFR & agr; Pool, es beweist nicht, dass die niedrige CNTFR & agr; Expression allein für die reduzierte zelluläre Reaktion ausmacht. Somit können Änderungen – resultierend aus Vorstimulation oder Transfektion – in jedem der Funktionselemente des Signalwegs stromaufwärts pSTAT3 kann der veränderten Reaktion beigetragen haben.
Das Grundkonzept des Protokolls ist nicht auf diese beschränkt insbesonlar-Rezeptor-System. (. Dh eine andere Zelllinie, andere Antikörper, andere Liganden, usw.) durch das Protokoll modifizieren kann verwendet werden , um die Ligand-induzierte Herabregulation von anderen Rezeptoren als auch zu bestimmen – unabhängig von sorLA's Beteiligung. Es sollte jedoch angemerkt werden , dass die Analyse von Rezeptor-Herabregulierung durch Western – Blotting hauptsächlich für Rezeptoren geeignet ist, beispielsweise GPI-verankerten Rezeptoren, die einen langsamen Umsatz und einen geringen Grad an Neusynthese in unstimulierten Zellen aufweisen. Damit eine hohe new-Synthese, Liganden-induzierte Herunterregulation kann kompensiert werden, indem die Synthese neuer Rezeptoren Rezeptoren zeigt. Unter diesen Umständen kann die Herunterregulierung des Rezeptors Pool anstatt durch metabolische Markierung und Puls-Chase – Experimente bestimmt werden , wie in 21 beschrieben. Alternativ jodhaltigen Antikörper (vorzugsweise Fc-Fragmente), die auf "Tag" die Ektodomäne des recept verwendet werden kann, nicht mit Rezeptor stören Bindungoder, und das erwartete Herunterregulierung kann dann durch radioaktive Zählung von Zellpellet und Medium bestimmt werden.
Aus logistischen Gründen transfizierten wir unsere Zellen mit einer CNTFR & agr; konstruieren ein Myc-Tag trägt, und im vorliegenden Protokoll ein Maus-Anti-Myc-Antikörper wurde Western-Blot-Nachweis des Rezeptors verwendet. Im Gegensatz dazu ist ein Antikörper, Ziege-anti-CNTFR & agr; wurde für Immunzytochemie und Doppelmarkierung als LAMP-1, die von einem Maus-Antikörpers nachgewiesen wurde – und natürlich zwei primären Maus-Antikörper verwenden, in unspezifischer (überlappend) Färbung mit sekundärem Antikörper führen würde. Man beachte, dass, da die Ziege anti-CNTFR & agr; arbeitet auch in Western Blot (nicht gezeigt) könnte das Protokoll leicht modifiziert und an Zellen, transfiziert mit CNTFR & agr; unmarkierte angewendet werden.
Schließlich wurde vor kurzem gezeigt worden , dass auch der endozytotischen Rezeptors bindet sortilin CLC: CLF-1 mit hoher Affinität 22. So ist es denkbar, dass sortilin, wiesorLA, Verbindungen zu CLC: CNTFR & agr; über CLF-1 und ist in der Lage Endozytose und lysosomalen von CNTFR & agr; als auch gezielt zu vermitteln. Mit sortilin anstelle von sorLA kann das vorliegende Protokoll verwendet werden, um diese Frage zu klären.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
Dulbecco Modified Eagle´s Medium | Lonza | BE12-604F/U1 | |
Fetal bovine serum | Thermo Scientific | 10270106 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
Dulbecco Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30028.02 | |
CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
LDS sample Buffer (4X) | Novex | NP0007 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
4% paraformaldehyde | VWR | 97,135,000 | |
Saponin | Sigma | S7900-100G | |
Mounting Media | Dako | S3023 |