SorLA und CLC: CLF-1-abhängige Herunterregulieren von CNTFR & agr; als Demonstriert durch Western Blotting, Hemmung der lysosomale Enzyme und Immunzytochemie

1. Western Blotting von CNTFR & agr; Lysate Express in voller Länge sorLA und Myc-markierte CNTFR & agr; Konstrukte in humanen embryonalen Nieren-293 (HEK 293) Zellen unter Verwendung von pcDNA3.1 / Zeo (-) und pcDNA3.1 / Hyg (-), respectively. Transfizieren die HEK293-Zellen mit den Konstrukten Kommerzielle Transfektionsreagenz nach Hersteller Protokoll. Wählen stabile Klone in Medium , enthaltend 150 ug / ml Zeocin und / oder 500 ug / ml Hygromycin B Gold – 13. Seed gleiche Anzahlen von HEK293 Transfektanten exprimieren entweder CNTFR & agr;-Myc oder co-exprimierenden CNTFR & agr;-Myc / sorLA in zwei 4-Well – Platten , wie in 1 gezeigt Kultur die Zellen in Dulbecco Modified Adler Medium (DMEM) , ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (Vollmedium) in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 ° C. Warten Sie, bis die Zellen 50-80% konfluent. Entfernen Sie das Medium aus derBrunnen, waschen Sie einmal mit Dulbecco Phosphat – gepufferte Saline (DPBS) und frisch mit oder ohne (Kontrolle) 10 nM CLC volle Medium hinzu: CLF-1 , wie in Abbildung 1 dargestellt. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C. Nach 0 und 5 h Inkubation erholen das Medium und speichern sie bei 4 ° C in 1,5 ml-Röhrchen. Dann fügen 1% Triton X-100 Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0), ergänzt mit einem Proteinase-Inhibitor-Cocktail zu jeder Vertiefung (1 min, 4 C). Anschließend übertragen die Zelllysate auf 1,5 ml-Röhrchen (4 ° C). Drehen Sie die Rohre des Mediums und Zelllysat (3000 × g, 3 min, 4 ° C) und übertragen Sie die Überstände bis 1,5 ml-Röhrchen (4 ° C) enthält. Entsorgen Sie das Pellet. Jeweils 5 ul jeder Zelle Lysatüberstand neue 1,5 ml-Röhrchen – verwenden sie später um den Proteingehalt zu messen (Schritt 1.7). Sofort in den alle den überständen nichtreduzierende LDS-Probenpuffer und die Proben verwirbeln. Verwenden Sie die 5 & mgr; l-Aliquots der Prot zu messenein Gehalt in den Überständen Zelllysat Kommerzielle Proteinassay nach Herstellerprotokoll verwendet. Erhitzen Sie die Proben bei 95 ° C für 5 min. Unterwerfen eine gleiche Menge an Protein aus jeder Probe zu reduzierenden SDS-PAGE 13 und Western – 13 – Blotting und zu visualisieren , den Inhalt sorLA, β-Actin, und CNTFR & agr;-Myc in dem Medium und in den Zell – Lysaten unter Verwendung von Kaninchen – anti-sorLA 16 (5 ug / ml), Maus-anti-β-Actin (0,4 ug / ml) und Maus-Anti-Myc (1 ug / ml) Antikörper und die entsprechenden HRP-verknüpfte Sekundärantikörper (1: 2000). Quantifizieren Sie die Bänder durch Densitometrie nach dem Protokoll des Herstellers. 2. Immunzytochemie in Kombination mit lysosomale Hemmstoffe Seed HEK293 Zellen , die stabil mit CNTFR & agr;-Myc / sorLA auf Abdeckung gleitet in einer 4-Well – Platte transfiziert , wie in Abbildung 2 dargestellt. Kultur die Zellen in Vollmedium wie oben. Warten Sie, bis Zellkonfluenz 20 – 40%. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und fügen Sie vollen Medium mit oder ohne 50 & mgr; g / ml Leupeptin und Pepstatin A (leu / pep) (hemmt lysosomale Hydrolasen) zu den Zellen , wie in Abbildung 2 dargestellt. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C. Das Medium muss alle 6 h während der folgenden 24 h Inkubation ersetzt werden. Nach 24 h Inkubation ersetzen erneut das Medium (mit oder ohne leu / pep) und dieses Mal 10 nM CLC hinzu: CLF-1. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 5 h. Waschen Sie die Zellen einmal in PBS und fixieren sie in 4% Paraformaldehyd, pH 7 für 15 min bei RT. Achtung: Paraformaldehyd ist hochgiftig, sollte der Kontakt mit der Haut, Augen und Schleimhäute. Handschuhe und Schutzbrille sollte innerhalb einer Abzugshaube getragen und Lösungen hergestellt werden. Waschen Sie die einmal Zellen in PBS und Permeabilisierung der Zellen für 5 min bei RT in Saponin verdünnt in PBS (0,5% Saponin). Verdünnte Ziege-Anti-CNTFR & agr; (1 & mgr; g / mL) (insbesonderenicht der Maus-Anti-Myc für Western-Blotting verwendet) und Maus-anti-LAMP-1 (15 ug / ml) Antikörper in 0,5% Saponin und die Zellen mit den Antikörpern für 2 h bei RT inkubiert. Waschen Sie die Zellen 4x (5 min) in 0,5% Saponin und Inkubation der Zellen mit Esel anti-Ziege Alexa 488- und Esel anti-Maus-Alexa 568-konjugierten Sekundärantikörper (6 ug / ml) für 2 h bei RT. Waschen Sie die Zellen 4x (5 min) in 0,5% Saponin, zweimal in entionisiertem Wasser (1 min), und montieren Sie die Abdeckung gleitet auf Mikroskop Montage Medien Folien verwenden. Analysieren Sie den Antikörper-Färbung der Zellen durch konfokale Mikroskopie mit einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop mit einem 63X C-Apochromat Wasserimmersionsobjektiv mit NA 1.2. 3. Western-Blot-Nachweis des pSTAT3 Stufe Seed HEK293-sorLA Zellen in einer 4-Well – Platte (die endogenen Konzentrationen von CNTFR & agr; exprimieren) , wie in Abbildung 3 dargestellt. Kultur die Zellen in Vollmedium wie oben. Warten Sie, bis dieZellen sind 50-80% konfluent. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen, waschen Sie einmal in PBS, und fügen Sie frisch Medium mit oder ohne 10 nM CLC: CLF-1 zu den Zellen , wie in Abbildung 3 dargestellt. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 5 h. Entfernen Sie das Medium, waschen Sie die zweimal Zellen in unsupplementierten DMEM (leeres Medium, ohne FBS und Antibiotika), und dann inkubieren die Zellen für 90 min (37 ° C) in leeres Medium. Wieder einmal, entfernen Sie das Medium und fügen Sie frische leeres Medium mit oder ohne 5 nM CLC: CLF-1 (STAT3 – Phosphorylierung zu initiieren) , wie in Abbildung 3 dargestellt. Inkubieren für 15 min bei 37 ° C. Schnell das Medium zu entfernen und die Zellen (1 min, 4 ° C) mit einem Proteinase-Inhibitor-Cocktail und einem Phosphatase-Inhibitor durch Zugabe von 1% Triton X-100 Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0), supplementiert lysieren Cocktail zu jeder Vertiefung. Anschließend übertragen die Zelllysate auf 1,5 ml-Röhrchen (4 ° C). Jeweils 5 & mgr; l of jeder Überstand auf neue 1,5 ml-Röhrchen – nutzen sie, um den Proteingehalt zu messen, später (Schritt 3.8). Sofort in den alle den überständen nichtreduzierende LDS-Probenpuffer und die Proben verwirbeln. Messung des Proteingehalts der 5 & mgr; l Aliquots Kommerzielle Proteinassay unter Verwendung von nach dem Protokoll des Herstellers. Beschallen jede Probe bei RT, bis sie nicht mehr viskos (ca. 1 min) und anschließend erwärmen sie bei 95 ° C für 5 min. Unterwerfen eine gleiche Menge an Protein aus jeder Probe einer SDS-PAGE 13 und Western – 13 – Blotting und zu visualisieren , den Inhalt pSTAT3 und insgesamt STAT3 in den Zelllysaten unter Verwendung von Kaninchen – anti-pSTAT3 (1: 2000) und Maus – Anti-STAT3 (1: 1,000 ) Antikörper und die entsprechenden HRP-verknüpften Maus und Kaninchen Sekundärantikörper (1: 2000). Quantifizieren Sie die Bänder durch Densitometrie nach dem Protokoll des Herstellers.