SorLAとCLC：ウェスタンブロッティング、リソソーム酵素の阻害、および免疫細胞化学によって実証されるようにCNTFRαのCLF-1依存ダウンレギュレーション
Summary
本プロトコルは、リソソーム酵素の阻害と組み合わせたウエスタンブロッティングおよび免疫細胞化学は、サイトカイン様因子1（CLF-1との相互作用によって搬送される毛様体神経栄養因子受容体α（CNTFRα）のダウンレギュレーションを示すために使用することができる方法について説明します）およびエンドサイトーシス受容体sorLA。
Abstract
ヘテロ二量体サイトカインカルジオトロフィン様サイトカイン：サイトカイン様因子-1（CLC：CLF-1）は、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）は、その後130 /白血病抑制因子受容体β（gp130のを/糖タンパク質リクルート三量体複合体を形成するためにCNTFRαを-anchoredターゲットにシグナリングのためLIFRβ）。 CLCとCNTFRαの両方は、シグナリングのために必要であるが、これまでCLF-1はCLC分泌の推定上のファシリテーターとして知られています。しかし、最近、CLF-1は、3種の結合部位を含有することが示された：CLCに1つ。 CNTFRαのための1つ（すなわち、三量体複合体の構築を促進することができます）。およびエンドサイトーシス受容体sorLAのための1つ。後者のサイトはCLC、CLF-1の高親和性結合を提供：CLF-1、ならびに三量体（CLC：CLF-1：CNTFRα）sorLAに複雑で、かつsorLA発現細胞可溶性リガンドCLF-1とCLCで：CLF-1は急速に取り込まれ、内在化されます。 CNTFRαとsorLAを共発現する細胞では、CNTFRαは最初のCLCをバインド：CLF-1を形成します膜結合型三量体複合体は、それはまた、CLF-1での無料sorLA結合部位を介してsorLAに接続します。その結果、独自にエンドサイトーシスのための能力を持っていないCNTFRαは、に沿って引っ張られ、CLCのsorLA媒介エンドサイトーシスによって内在：CLF-1。
現在のプロトコルは、i）を示すために使用される実験手順を説明しsorLA媒介とCLC：表面膜CNTFRα式のCLF-1依存ダウンレギュレーションを。 CNTFRαの標的II）sorLA媒介エンドサイトーシスおよびリソソーム;そしてiii）CLCに低下細胞応答：CNTFRαのsorLA媒介ダウンレギュレーション時にCLF-1刺激。
Introduction
CLF-1 1-3：CLCとCLF-1は、ヘテロサイトカインCLCの二つのサブユニットを構成しています。細胞シグナル誘導に、CLC：CLF-1第一のターゲットCNTFRα、その一次およびGPIアンカー型受容体は、膜結合三量体複合体を形成します。 CLC：CLF-1：CNTFRα複合体は、その後、転写3（JAK / STAT3）経路4のヤヌスキナーゼ/信号トランスデューサーおよびアクチベーターを介して膜貫通シグナル伝達を仲介するのgp130 /LIFRβを募集しています。 3つのサブユニットのいずれかを欠損したマウスは、1と同じ表現型を表示し、原因で顔面神経細胞および不十分な授乳5-8の数の減少に出生後24時間以内に死亡します。ヒトでの調査結果は、同様に、3つのサブユニットの機能的な一貫性を強調しています。このように、ヒトの変異（ホモ接合体または化合物）CLCの原因となる障害：CLF-1またはCNTFRα、いわゆる低温で誘導される発汗/ Crisponi症候群ですべての結果、このようなimpaiなどの症状を特徴とする状態赤授乳や嚥下、様々な異形症の特徴、温度の急上昇と、逆説的と低温9-11で発汗灌流。
インビトロでは、CLCとCNTFRαの組み合わせが必要とgp130 /LIFRβとの相互作用、細胞12内シグナル伝達の誘導に十分です。一方、CLF-1の役割はあまり明確ではありません。これは、直接シグナル伝達に関与しない、長主としてCLC 1の細胞分泌を促進するのに役立つ付録と考えられてきました。しかしながら、最近の知見は、CLF-1は、CLCとCNTFRαのシグナル伝達および代謝回転の両方が関与し、追加の、より重要な機能を有することを示します。したがって、CLF-1は、3つの独立した結合部位を含有すると思われる。その周知CLCへの結合のための1つを、 CNTFRαへの直接結合を媒介する1。およびエンドサイトーシス受容体sorLAとの相互作用のための第三（高親和性）サイト。 CLCとCLF-1の両方が見える＆＃として160; CLCよりもかなり低い親和性でCNTFRαを対象とする：CLF-1複合体は、（そのCNTFRα結合部位を介して）CLF-1はCLCとCNTFRαの統一を促進し、それによって13のシグナル伝達を容易にすることが考えられます。
sorLAとCLF-1の相互作用は、現在のプレゼンテーションの主な問題は、完全に異なる役割を果たしています。 SorLAはVps10pドメイン受容体ファミリー14を構成する5タイプ1受容体の一つです。これは、種々の組織ではなく、脳や神経組織15内の特定で表現されています。他のファミリーメンバーに類似sorLAはVps10pドメイン結合N末端リガンドを担持し、それに加えて、それはまた、低密度リポタンパク質受容体ファミリー15のメンバーに見られるリガンド結合要素を含む他のドメインの種類を含みます。その細胞質尾部は、 例えば 、いくつかのアダプタータンパク質と相互作用アダプタータンパク質-1、-2、およびsorLAは、効率的なendocytosを伝えますあるだけでなく、結合したタンパク質16-18の細胞内選別および輸送。 Vps10pドメインはCLF-1（しかし特に、CLCない）13を含む無関係なリガンドのシリーズを結合する大10枚羽根のβプロペラ19,20を備えます。 CLF-1および三量体複合体CLC：CLF-1：CNTFRα13 CLF-1中の結合部位があってもsorLAは無料CLF-1だけでなく、CLCないだけに結合することを意味CLCとCNTFRαとの複合体形成後もアクセス可能です。 SorLAはCLF-1およびCLCの急速なエンドサイトーシス伝える：CLF-1を、しかしCNTFRαは、GPIアンカーによって表面膜に固定されているのに対し、これらは、可溶性タンパク質です。 CLCの結合場合、問題はそのためです：CLF-1：/、および：CNTFRαはsorLAが複合体全体を内部化し、それによってCNTFRαの表面膜式（CLF-1信号の誘導およびCLCへのその後の細胞の感受性を）変更することができますまたはCNTFRαの売上高。
現在で記載した実験報告書は、以下の質問を明確にするために設計しました：
表面膜CNTFRαのCLF-1依存ダウンレギュレーション：sorLAはCLCを仲介していますか？これを明確にするために、それは最初に21で説明したように代謝標識およびパルスチェイス実験により（不在とsorLAの存在下で）CNTFRαの代謝回転を決定することを試みました。ただし、[S 35]システインおよび[S 35]メチオニンの混合物を使用してCNTFRαにラベルを付ける試みは、放射能の悪い取り込みを示しました。これは、すべての確率で受容体の急激かつ大幅な損失を補償することができないであろう新たな合成の非常に低い程度を、提案しました。 CLCを介して相互に接続するときCNTFRαがダウンレギュレートされたかどうかを確認するには：CLF-1 sorLAに、それは、したがって、単に前とCLCへの曝露後（ウェスタンブロッティングを使用して）CNTFRαの全細胞プールを測定することを決定しました：CLF-1は – との結果を比較します細胞にトランスフェクトされたかどうかをトランスフェクトしましたsorLA。
sorLAはリソソームにCNTFRαをターゲットにしていますか？この質問に答えるために、CNTFRαの局在 – そのCLCを介して内在化：CLF-1媒介sorLAへの結合は、 – 免疫細胞化学を用いて検討し、抗体による標識はCNTFRαと後期エンドソーム/リソソームマーカーリソソーム関連膜タンパク質1に向けました（LAMP-1）。実験は、同様に、未処理のリソソーム酵素の阻害剤で処理した細胞で行いました。アイデアはCNTFRαがリソソームで分解された場合、未処理の細胞はCNTFRαのためのほとんど、あるいは全く染色を示すことになるのに対し、酵素阻害剤で処理した細胞は、LAMP-1陽性の小胞に蓄積CNTFRα染色を提示することは当然でした。
CLF-1刺激：CNTFRαダウンレギュレーションは、CLCに対する細胞応答を下げていますか？ JAK / STAT3を使用してのgp130 /LIFRβヘテロ介して、CLC、CLF-1、およびCNTFRα信号からなる三量体複合体経路。したがって、CLCに応答する細胞の能力は：CNTFRαのダウンレギュレーション時にCLF-1シグナル伝達はsorLAトランスフェにおけるホスホSTAT3（のpSTAT3）/総STAT3レベルのウェスタンブロット検出および定量することにより調査しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、sorLA媒介CLCを実証するために特に使用することができます：CLF-1依存ダウンレギュレーションとCNTFRαの標的リソソーム、ならびにCLCに付随弱体化応答：CLF-1刺激。
彼らは、CNTFRαとsorLAのわずかな内因性発現を持って急行のgp130 /LIFRβ、トランスフェクションが容易であり、免疫細胞化学に適した大細胞体を、持っているとして、HEK293細胞株は、このプロトコルに適しています。しかし、理論的には類似の特性を有する任意の細胞株も同様に動作するはずです。
プロトコルは、2つの重要なステップがあります。最初の懸念はレイ/ PEP媒体を24時間、約6時間ごとに交換する必要がある2.3、ステップ。そうしないと、アクティブなリソソーム酵素の少ないまたはリソソームにおけるタンパク質の検出不可能な蓄積をもたらすことがあります。第二の重要なステップ（3.4）CLCでプレインキュベーションで洗浄懸念：CLF-1。それがimですportant未結合リガンドを除去するために、細胞の時間が非補充DMEM（ブランク培地）中で（続き刺激を避けて）回復できるようにします。 CLF-1（ステップ3.5）：これはCLCとその後の再刺激中のpSTAT3の低いバックグラウンドレベルを確保します。
なお、 図6は、細胞応答（のpSTAT3）はCNTFRαのsorLA媒介ダウンレギュレーションと並行して減少することを示しています。減少した応答がCNTFRαプールの減少によるものである（そして時に予想されること）が、それは単独で低CNTFRαの発現が減少した細胞応答を占めていることを証明していないことが強調されるべきです。したがって、変更 – 刺激前またはトランスフェクションから生じる – 上流のpSTAT3へのシグナル伝達経路の機能要素のいずれかでは、変更された応答に寄与している可能性があります。
プロトコルの基本的な概念は、このparticuに限定されるものではありませんLAR受容体システム。 （ すなわち、他の細胞株、他の抗体、他のリガンドなど ） -かかわらずsorLA's関与のプロトコルを変更することにより、他の受容体のリガンド誘導性下方制御を決定することができます。しかし、ウエスタンブロット法による受容体-ダウンレギュレーションの分析は、遅い売上高および非刺激細胞における新たな合成の低度を示す例えば 、GPIアンカー型受容体、受容体のために主に適していることに留意すべきです。したがって、新たな合成の高レベルを示す受容体で、リガンド誘導性下方制御は、新たな受容体を合成することによって補償することができます。 21に記載されるように、これらの状況下では、受容体プールのダウンレギュレーションは、代わりに、代謝標識し、パルスチェイス実験によって決定することができます。代替的に、受容体を妨害しないヨウ素化抗体（好ましくたFc断片）は、「タグ」RECEPTの細胞外ドメインに使用することができる結合しますまたは、及び予想される下方制御は、次いで、細胞ペレットおよび培地の放射能計数によって決定することができます。
ロジスティックな理由から、私たちはCNTFRαと私たちの細胞がMycのタグを運ぶ構築トランスフェクションされ、本プロトコルでは、マウス抗Myc抗体は、受容体のウェスタンブロット検出のために使用しました。対照的に、LAMP-1は、マウス抗体によって検出されたように、ヤギ抗CNTFRα抗体は、免疫細胞化学および二重標識のために使用した – 二つの主要なマウス抗体を使用して明らかにする二次抗体との非特異的な（重複）染色をもたらします。ヤギ抗CNTFRαも（図示せず）ウェスタンブロッティングで動作するので、プロトコルは簡単に変更し、タグなしCNTFRαでトランスフェクトした細胞に適用することができることに注意してください。
高親和性の22 CLF-1：最後に、最近では、エンドサイトーシス受容体ソルチリンがCLCに結合することが示されています。したがって、それは次のように、考えられることソルチリンですsorLA、CLCへの相互接続：CLF-1を介してCNTFRαと同様CNTFRαの標的エンドサイトーシスおよびリソソームを仲介することができます。代わりsorLAのソルチリンを使用して、現在のプロトコルは、この問題を明確にするために使用することができます。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
| 4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
| Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| Dulbecco Modified Eagle´s Medium | Lonza | BE12-604F/U1 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30028.02 | |
| CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
| Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
| Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
| Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
| Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
| Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
| Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
| Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
| Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
| Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
| Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
| Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
| Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
| Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
| Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
| Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
| EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
| cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
| LDS sample Buffer (4X) | Novex | NP0007 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 4% paraformaldehyde | VWR | 97,135,000 | |
| Saponin | Sigma | S7900-100G | |
| Mounting Media | Dako | S3023 |
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