O presente protocolo descreve como blotting e imunocitoquímica combinada com a inibição de enzimas lisossomais ocidental pode ser utilizado para demonstrar a regulação negativa da neurotrófico ciliar do Receptor do Factor-α (CNTFRa), que é transportado pela interacção entre citocinas como factor-1 (CLF-1 ) e o receptor endocítico sorLA.
A citoquina heterodimérica-Cardiotrofina como citocinas: Cytokine-like factor-1 (CLC: CLF-1) tem como alvo a glicosilfosfatidilinositol (GPI) ancorada CNTFRa para formar um complexo trimérico que subsequentemente recrutas glicoproteína 130 / Factor Inibidor da Leucemia Receptor-β (gp130 / LIFRp) para a sinalização. Ambos CLC e CNTFRa são necessários para a sinalização, mas até agora CLF-1 só tem sido conhecida como um mediador putativo de secreção CLC. No entanto, recentemente, tem sido mostrado que CLF-1 contém três locais de ligação: um para CLC; um para CNTFRa (que podem promover a montagem do complexo trimérico); e um para o receptor endocítico sorLA. Este último local fornece a ligação de CLF-1, CLC alta afinidade: CLF-1, bem como a trimérica (CLC: CLF-1: CNTFRa) complexo para sorLA, e em células sorLA que expressam os ligandos solúveis CLF-1 e CLC : CLF-1 são tomadas rapidamente para cima e internalizado. Em células co-expressando CNTFRa e sorLA, CNTFRa liga primeira CLC: CLF-1 para formarum complexo trimérico associada a membrana, mas também conecta a sorLA através do local de ligação sorLA livre em CLF-1. Como resultado, CNTFRa, que não tem capacidade para endocitose por si só, é puxou ao longo e internalizado por endocitose mediada por sorLA de CLC: CLF-1.
O presente protocolo descreve os procedimentos experimentais utilizados para demonstrar i) a sorLA-mediada e CLC: downregulation CLF-1-dependente de expressão CNTFRa-superfície da membrana; ii) a endocitose e direccionamento lisossomal de CNTFRa sorLA mediada; e iii) a resposta celular reduzido para CLC: CLF-1-estimulação sobre a regulação negativa sorLA-mediada de CNTFRa.
O CLC e CLF-1 constituem as duas subunidades da CLC citocina heterodimérica: CLF-1 1-3. Para a indução do sinal celular, a CLC: CLF-1 primeiros alvos a CNTFRa, seu receptor primário e ancoradas a GPI, de modo a formar um complexo trimérico ligada à membrana. O CLC: CLF-1: CNTFRa complexo posteriormente recruta gp130 / LIFRp que medeia a sinalização trans através das quinases Janus / transdutores de sinal e activadores de transcrição 3 (JAK / STAT3) pathway 4. Os ratinhos deficientes em qualquer uma das três subunidades exibir um e o mesmo fenótipo e morrem dentro de 24 horas após o nascimento devido a uma redução do número de neurónios faciais e insuficiente sucção 5-8. Achados em humanos da mesma forma sublinhar a coerência funcional dos três subunidades. Assim, mutações humanas (homozigotas ou compostos) causando disfunção da CVX: CLF-1 ou CNTFRa, resultam em síndrome da chamada transpiração induzida pelo frio / Crisponi, um estado caracterizado por sintomas tais como impaisucção vermelho e deglutição, várias características dismórficas, picos de temperatura, e paradoxal e Perfundir suando a baixas temperaturas 9-11.
In vitro, a combinação de CLC e CNTFRa é necessário e suficiente para a interacção com gp130 / LIFRp e a indução de sinalização em células 12. O papel de CLF-1 por outro lado, é menos claro. Ele não está directamente envolvido na sinalização, e tem sido considerado como um apêndice que serve principalmente para facilitar a secreção celular de CVX 1. No entanto, descobertas recentes mostram que CLF-1 tem funções adicionais e mais importantes que implicam tanto a sinalização e volume de negócios de CLC e CNTFRa. Assim, parece que CLF-1 contém três locais de ligação independentes: um para a sua bem conhecida ligação a CLC; um que medeia a ligação directa para o CNTFRa; e um terceiro local (elevada afinidade) para a interacção com o receptor de endocitose sorLA. Como ambos CLC e CLF-1 parecem & #160; a meta CNTFRa com uma afinidade mais baixa considerável do que a CLC: Complexo CLF-1, é concebível que CLF-1 (através do seu sítio de ligação CNTFRa) promove a unificação da CLC e CNTFRa e, assim, facilita a sinalização 13.
A interação de CLF-1 com sorLA, a questão principal da presente apresentação, desempenha um papel completamente diferente. SorLA é um dos receptores de cinco tipo 1 que constituem a família de receptores de Vps10p-domínio 14. É expresso numa variedade de tecidos, mas em particular no cérebro e tecidos neuronais 15. Semelhante a outros membros da família sorLA transporta uma ligação Vps10p-ligando de domínio N-terminal, mas, além disso, que também compreende outros tipos de domínio, incluindo os elementos de ligação de ligandos encontrados em membros da família de baixa densidade do receptor de lipoproteína de 15. Sua cauda citoplasmática interage com diversas proteínas adaptadoras, por exemplo, proteína-1 adaptador e -2, e sorLA transmite endocytos eficientesÉ bem como triagem intracelular e transporte de proteínas ligadas 16-18. O Vps10p-domain compreende um grande dez lâminas β-hélice 19,20, que liga uma série de ligantes independentes, incluindo CLF-1 (mas notavelmente, não CLC) 13. O local de ligação no CLF-1 é acessível, mesmo após a formação do complexo com CLC e CNTFRa o que significa que sorLA liga não só livre CLF-1, mas também CLC: CLF-1 eo trimérico CLC complexo: CLF-1: CNTFRa 13. SorLA transmite rápida endocitose de CLF-1 e CLC: CLF-1, mas estes são proteínas solúveis enquanto que CNTFRa é fixado à superfície da membrana por uma âncora GPI. A questão é, por conseguinte, se a ligação de CLC: CLF-1: CNTFRa permite sorLA para internalizar todo o complexo e, assim, alterar a expressão à superfície da membrana de CNTFRa (e a subsequente susceptibilidade celular à CLC: CLF-1 indução de sinal), e / ou o volume de negócios CNTFRa.
As experiências descritas no presenterelatório foram projetados para esclarecer as seguintes questões:
Será sorLA mediar CLC: downregulation CLF-1 dependente da superfície da membrana CNTFRa? Para esclarecer isso, foi inicialmente tentaram determinar o volume de negócios CNTFRa (na ausência e presença de sorLA) por meio de rotulagem e pulse-chase experimentos metabólicos como descrito no 21. No entanto, as tentativas de rotular CNTFRa utilizando uma mistura de [S 35] cistea e [35 S] -metionina revelou uma fraca incorporação de radioactividade. Isto sugeriu um grau muito baixo de novo-síntese, que com toda a probabilidade seria incapaz de compensar a perda súbita e significativa de receptores. Para determinar se CNTFRa foi reprimidos quando interligados através CLC: CLF-1 para sorLA, foi, portanto, decidiu que simplesmente medir (utilizando Western blot) da piscina celular total de CNTFRa antes e depois da exposição a CLC: CLF-1 – e comparar resultados em células transf ectadas ou não transfectadas comsorLA.
Será sorLA alvo CNTFRa para lisossomos? Para responder a esta pergunta, a localização de CNTFRa – internalizada através do seu CLC: CLF-1 mediada por ligação a sorLA – foi examinada usando imunocitoquímica e marcação com anticorpos dirigidos para CNTFRa e do late-endosome / lisossoma marcador Lisossomal-associados proteína de membrana 1 (LAMP-1). A experiência foi realizada em células tratadas como não tratadas bem como com inibidores de enzimas lisossomais. A ideia era de curso que se CNTFRa foi degradada em lisossomas, as células tratadas com inibidores da enzima iria apresentar-CNTFRa coloração acumulando em LAMP-1 vesículas positivas, enquanto que as células não tratadas que apresentam pouca ou nenhuma coloração para CNTFRa.
Será CNTFRa downregulation diminuir a resposta celular ao CLC: CLF-1 de estimulação? O complexo trimérico consistindo de CVX, CLF-1, e os sinais de CNTFRa através da gp130 / heterodímero LIFRp usando o JAK / STAT3via. Por conseguinte, a capacidade das células para responder a CLC: CLF-1 sinalização sobre a regulação negativa de CNTFRa foi explorada por detecção de mancha de Western e de quantificação do nível de fosfo-STAT3 STAT3 (pSTAT3) / Total em transfectantes sorLA.
O protocolo aqui descrito pode ser utilizado especificamente para demonstrar a CLC-sorLA mediada: downregulation CLF-1-dependente e de direccionamento lisossomal de CNTFRa, bem como a resposta enfraquecida que acompanha a CLC: CLF-1 de estimulação.
A linha celular HEK293 que é bem adequado para este protocolo, uma vez que tem apenas uma menor expressão endógena de CNTFRa e sorLA, são fáceis de transfectar, expressa gp130 / LIFRp, e tem uma grande massa de células, o que é adequado para imunocitoquímica. No entanto, em teoria, qualquer linha de células com propriedades semelhantes devem funcionar tão bem.
O protocolo tem dois passos críticos. A primeira diz respeito a etapa 2.3, em que o meio de Leu / PEP deve ser substituído aproximadamente a cada 6 h durante 24 h. Não fazer isso pode resultar em enzimas lisossomais ativos e menos ou nenhuma acumulação detectável de proteína nos lisossomos. O segundo passo crítico (3.4) preocupações de lavagem mediante pré-incubação com CLC: CLF-1. É importante para remover qualquer ligando não ligado, e para permitir que o tempo para recuperar células (evitando a estimulação contínua) em DMEM sem suplementos (meio em branco). Isso irá garantir um baixo nível de fundo de pSTAT3 durante a posterior re-estimulação com CLC: CLF-1 (passo 3.5).
Nomeadamente, a Figura 6 demonstra que a resposta celular (pSTAT3) diminui em paralelo com o downregulation sorLA-mediada de CNTFRa. Deve sublinhar-se no entanto, que, apesar de uma resposta reduzida é de acordo com o (e que se espera em cima) uma redução da piscina CNTFRa, não prova que a expressão de baixo CNTFRa só por si representa a resposta celular reduzida. Assim, as mudanças – resultantes da pré-estimulação ou transfecção – em qualquer um dos elementos funcionais da via de sinalização a montante de pSTAT3 pode ter contribuído para a resposta alterada.
O conceito básico do protocolo não está limitada a esta particusistema receptor lar. (. Isto é, uma outra linha celular, outros anticorpos, outros ligandos, etc), modificando o protocolo pode ser utilizado para determinar a regulação negativa induzida pelo ligando de outros receptores, bem como – independentemente de envolvimento sorLA's. No entanto, deve notar-se que a análise da regulação negativa do receptor-por transferência de Western é adequado principalmente para os receptores, por exemplo, receptores ancoradas por GPI, que apresentam um volume de negócios lento e um baixo grau de nova síntese em células não estimuladas. Assim, em receptores que mostram um alto nível de síntese nova, a regulação negativa induzida pelo ligando podem ser compensados por síntese de novos receptores. Sob estas circunstâncias, a regulação negativa do receptor de piscina pode em vez disso ser determinada por meio de rotulagem e pulse-chase experiências metabólicas tal como descrito em 21. Alternativamente, os anticorpos (de preferência iodados Fc fragmentos) que não interferem com a ligação ao receptor pode ser utilizado para "marcar" o ectodomínio do receptou, e a regulação negativa esperada pode ser então determinada por contagem radioactiva de sedimento de células e meio.
Por razões logísticas que transfectadas nossas células com um CNTFRa construir carregando uma Myc-tag, e no presente protocolo foi utilizado um anticorpo anti-Myc mouse para o blot de detecção ocidental do receptor. Em contraste, foi utilizado um anticorpo anti-cabra CNTFRa por imunocitoquímica e a dupla marcação de LAMP-1 foi detectada por um anticorpo de ratinho – e, obviamente, da utilização de dois anticorpos primários de ratinho resultaria em (sobreposição) coloração não específica com anticorpos secundários. Note-se que uma vez que o anticorpo de cabra anti-CNTFRa também funciona em Western blotting (não mostrado), o protocolo pode ser facilmente modificada e aplicado a células transfectadas com CNTFRa não marcado.
Finalmente, foi recentemente mostrado que também o sortilina receptor endocítico liga CLC: CLF-1 com alta afinidade 22. Assim, é concebível que sortilina, comosorLA, interliga a CLC: CNTFRa via CLF-1 e é capaz de mediar a endocitose e lisossomal de CNTFRa também. Usando sortilin vez de sorLA, o presente protocolo pode ser usado para esclarecer esta questão.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
Dulbecco Modified Eagle´s Medium | Lonza | BE12-604F/U1 | |
Fetal bovine serum | Thermo Scientific | 10270106 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
Dulbecco Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30028.02 | |
CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
LDS sample Buffer (4X) | Novex | NP0007 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
4% paraformaldehyde | VWR | 97,135,000 | |
Saponin | Sigma | S7900-100G | |
Mounting Media | Dako | S3023 |