SorLA en CLC: CLF-1-afhankelijke negatieve regulatie van CNTFRa zoals aangetoond door Western blotting, Remming van lysosomale enzymen en immunocytochemie
Summary
Dit protocol beschrijft hoe Western blotting en immunocytochemie gecombineerd met remming van lysosomale enzymen kunnen worden gebruikt om de neerwaartse regulatie van ciliaire neurotrofe factor receptor-α (CNTFRa), die wordt overgebracht door de interactie tussen cytokine-achtige factor-1 (CLF-1 tonen ) en de endocytosereceptor sorLA.
Abstract
De heterodimere cytokine cardiotrofine-achtige cytokine: cytokine-achtige Factor-1 (CLC: CLF-1) richt zich op de glycosylphosphatidylinositol (GPI) -anchored CNTFRa een trimere complex dat vervolgens rekruten glycoproteïne 130 / Leukemie Remmende Factor Receptor-β vormen (gp130 / LIFRB) voor signalering. Zowel CLC en CNTFRa nodig zijn voor signalering, maar tot nu toe CLF-1 is alleen bekend als een vermeende facilitator van CLC secretie. Er is echter onlangs aangetoond dat CLF-1 bevat drie bindingsplaatsen: één voor CLC; een voor CNTFRa (die kunnen assemblage van het trimere complex te bevorderen); en één voor de endocytosereceptor sorLA. De laatste locatie biedt een hoge affiniteit binding van CLF-1, CLC: CLF-1, en de trimere (CLC: CLF-1: CNTFRa) complex sorLA, en sorLA-exprimerende cellen de oplosbare liganden CLF-1 en CLC : CLF-1 worden snel opgepakt en geïnternaliseerd. In cellen die co-expressie CNTFRa en sorLA, CNTFRa bindt eerste CLC: CLF-1 te vormeneen membraangebonden trimere complex, maar het verbindt ook sorLA via de vrije sorLA bindingsplaats in CLF-1. Hierdoor CNTFRa, die geen mogelijkheid voor endocytose kan zelf wordt gerukt langs en geïnternaliseerd door de sorLA-gemedieerde endocytose van CLC: CLF-1.
Het huidige protocol beschrijft de experimentele procedures die worden gebruikt om aan te tonen i) de sorLA-gemedieerde en CLC: CLF-1-afhankelijke downregulatie van oppervlakte-membraan CNTFRa meningsuiting; ii) sorLA-gemedieerde endocytose en lysosomale targeting van CNTFRa; en iii) de verlaagde cellulaire respons op CLC: CLF-1-stimulatie na sorLA-gemedieerde downregulatie van CNTFRa.
Introduction
De CLC en CLF-1 vormen de twee subeenheden van het heterodimere cytokine CLC: CLF-januari 1-3. Voor mobiele signaal inductie, CLC: CLF-1 de eerste doelstellingen van de CNTFRa, zijn primaire en GPI-verankerd receptor, een membraangebonden trimere complex te vormen. De CLC: CLF-1: CNTFRa complex vervolgens werft gp130 / LIFRB die bemiddelt transmembraan signalering via de Janus Kinase / Signal Transducers en Activators van transcriptie 3 (JAK / STAT3) route 4. Muizen waarin een van de drie subeenheden tonen eenzelfde fenotype en sterven binnen 24 uur na de geboorte als gevolg van een verminderd aantal gezichts- neuronen en onvoldoende zuigen 5-8. Bevindingen bij de mens ook onderstrepen de functionele samenhang van de drie subeenheden. Aldus menselijke mutaties (homozygoot of samengesteld) veroorzaakt disfunctioneren van CLC: CLF-1 of CNTFRa, resulteren alle in de zogenaamde zweten koude-geïnduceerde / Crisponi syndroom, een aandoening gekenmerkt door symptomen zoals impairode zuigen en slikken, diverse dysmorfie, temperatuur spikes, en paradoxaal en perfuseren zweten bij lage temperaturen 9-11.
In vitro, de combinatie van CLC en CNTFRa is zowel noodzakelijk als voldoende voor interactie met gp130 / LIFRB en de inductie van signalering in cellen 12. De rol van CLF-1 aan de andere kant is minder duidelijk. Het is niet direct betrokken bij signalering, en is lange tijd beschouwd als een bijlage die vooral dient om de cellulaire secretie van CLC 1 te vergemakkelijken. Echter, de recente bevindingen blijkt dat CLF-1 heeft extra en meer belangrijke functies impliceert zowel de signalering en de omzet van de CLC en CNTFRa. Het blijkt dus dat de CLF-1 bevat drie onafhankelijke bindingsplaatsen: een voor de bekende binding aan CLC; die directe binding aan het CNTFRa medieert; en een derde (hoge affiniteit) site voor interactie met de endocytosereceptor sorLA. Aangezien zowel CLC en CLF-1 lijkt & #160, te richten CNTFRa met een aanzienlijk lagere affiniteit dan de CLC: CLF-1 complex, is het denkbaar dat de CLF-1 (via de CNTFRa-bindingsplaats) bevordert de vereniging van CLC en CNTFRa en vergemakkelijkt daardoor 13 signalering.
CLF-1 interactie met sorLA, het belangrijkste probleem van de presentatie, speelt een heel andere rol. SorLA is één van de vijf type 1 receptoren die de Vps10p-domein receptorfamilie 14 vormen. Het wordt uitgedrukt in verschillende weefsels, maar met name in de hersenen en neuronale weefsels 15. Vergelijkbaar met de andere familieleden sorLA draagt een N-terminale ligand bindende Vps10p-domein, maar daarnaast omvat bovendien andere domein zoals ligandbindende elementen gevonden in leden van de low-density lipoprotein receptor familie 15. De cytoplasmatische staart samenwerkt met verschillende adapter eiwitten, bijvoorbeeld adapter eiwit-1 en -2 en sorLA vervoert efficiënte endocytosis en intracellulair transport sorteren en gebonden eiwitten 16-18. De Vps10p-domein een grote tien-bladed propeller β 19,20, die een aantal niet-gerelateerde liganden zoals CLF-1 (maar met name niet CLC) 13 bindt. De bindingsplaats in CLF-1 is toegankelijk, zelfs na complex formatie met CLC en CNTFRa wat betekent dat sorLA bindt niet alleen gratis CLF-1, maar ook CLC: CLF-1 en de trimere complex CLC: CLF-1: CNTFRa 13. SorLA brengt snelle endocytose van CLF-1 en CLC: CLF-1, maar deze zijn oplosbare eiwitten dat CNTFRa is bevestigd aan het oppervlak membraan door een GPI-anker. De vraag wordt dus als binding van CLC: CLF-1: CNTFRa laat sorLA alles te kunnen internaliseren en daardoor de oppervlakte-membraan expressie van CNTFRa (en de daaropvolgende cellulaire gevoeligheid voor CLC: CLF-1 signaal inductie) te wijzigen en / of de omzet van CNTFRa.
De experimenten in de onderhavige beschrevenrapport werden ontworpen om de volgende vragen te verduidelijken:
Heeft sorLA bemiddelen CLC: CLF-1-afhankelijke downregulatie van oppervlakte-membraan CNTFRa? Om dit te verduidelijken, werd in eerste instantie geprobeerd om de omzet van CNTFRa bepalen (in de afwezigheid en aanwezigheid van sorLA) door middel van metabole etikettering en pulse-chase experimenten zoals beschreven in 21. Pogingen labelen CNTFRa een mengsel van [S 35] cysteine en [S 35] methionine vertoonde slechte opname van radioactiviteit. Dit suggereert een zeer geringe mate van nieuwe synthese, die naar alle waarschijnlijkheid niet compenseren plotseling en aanzienlijk verlies van receptoren zou zijn. Om te bepalen of CNTFRa werd neerwaarts gereguleerd wanneer verbonden via CLC: CLF-1 tot sorLA, werd daarom besloten gewoon te meten (met behulp van Western blotting) de totale cellulaire pool van CNTFRa vóór en na blootstelling aan CLC: CLF-1 – en de resultaten te vergelijken in cellen die al dan niet getransfecteerd metsorLA.
Heeft sorLA richten CNTFRa naar lysosomen? Om deze vraag, de lokalisatie van CNTFRa beantwoorden – geïnternaliseerd via de CLC: CLF-1-gemedieerde binding aan sorLA – werd onderzocht met behulp van immunocytochemie, en labeling met antilichamen gericht CNTFRa en de late-endosome / lysosoom marker Lysosomale-geassocieerde membraaneiwit 1 (LAMP-1). Het experiment werd uitgevoerd op cellen en behandeld als onbehandeld met remmers van lysosomale enzymen. Het idee was natuurlijk dat als CNTFRa werd afgebroken in lysosomen, cellen behandeld met enzym-remmers zou CNTFRa-kleuring zich ophopen in LAMP-1 positieve blaasjes te presenteren, terwijl onbehandelde cellen weinig of geen kleuring voor CNTFRa zou laten zien.
Heeft CNTFRa downregulatie lager de cellulaire respons op CLC: CLF-1 stimulatie? Het trimere complex van CLC, CLF-1 en CNTFRa signalen via de gp130 / LIFRB heterodimeer met de JAK / STAT3pathway. Derhalve het vermogen van cellen om te reageren op CLC: CLF-1 signalering bij downregulatie van CNTFRa werd onderzocht door Western blot detectie en kwantificering van fosfo-STAT3 (pSTAT3) / totaal STAT3 niveau sorLA transfectanten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven protocol kan specifiek worden gebruikt om de sorLA-gemedieerde CLC tonen: CLF-1-afhankelijke downregulatie en lysosomale targeting van CNTFRa, alsmede de bijbehorende verzwakte reactie op CLC: CLF-1 stimulatie.
De HEK293 cellijn is zeer geschikt voor dit protocol, aangezien ze slechts een geringe endogene expressie van CNTFRa en sorLA, zijn gemakkelijk te transfecteren, express gp130 / LIFRB, en hebben een grote cel lichaam, dat geschikt is voor immunocytochemie. In theorie elke cellijn met gelijke eigenschappen moeten zo goed werkt.
Het protocol heeft twee kritische stappen. De eerste betreft stap 2,3, waarbij de leu / pep medium worden vervangen ongeveer elke 6 uur gedurende 24 uur. Doet u dit niet kan leiden tot actieve lysosomale enzymen en minder of geen detecteerbare ophoping van eiwitten in de lysosomen. De tweede belangrijke stap (3.4) heeft betrekking op het wassen na pre-incubatie met CLC: CLF-1. Het is imlangrijk om eventuele niet-gebonden ligand te verwijderen, en om de cellen tijd om te herstellen (het vermijden van verdere stimulatie) in unsupplemented DMEM (blank gemiddeld). Dit zal zorgen voor een laag achtergrondniveau van pSTAT3 tijdens de daaropvolgende re-stimulatie met CLC: CLF-1 (stap 3.5).
Met name figuur 6 toont aan dat de cellulaire respons (pSTAT3) daalt parallel met de sorLA-gemedieerde downregulatie van CNTFRa. Er zij evenwel op gewezen, dat hoewel een verminderde respons in overeenstemming met (en bij verwachting) een verlaging van de CNTFRa pool, bewijst dit niet dat de lage CNTFRa expressie alleen al de verminderde cellulaire respons. Aldus verandert – verkregen uit pre-stimulatie of transfectie – kunnen in een van de functionele elementen van de signaleringsroute stroomopwaarts pSTAT3 hebben bijgedragen aan de veranderde respons.
Het basisconcept van het protocol is niet beperkt tot deze bijzonLAR-receptor-systeem. (. Dwz een cellijn, andere antilichamen, andere liganden, etc.) door het modificeren van het protocol kan worden gebruikt om de ligand-geïnduceerde downregulatie van andere receptoren en bepalen – ongeacht sorLA's betrokkenheid. Er moet echter worden opgemerkt dat de analyse van receptor-downregulatie door Western blotting vooral geschikt voor Receptoren bijvoorbeeld GPI-verankerde receptoren, die een trage omzet en een lage nieuwe synthese in niet-gestimuleerde cellen vertonen. Dus in receptoren die een hoge mate van nieuwe synthese-ligand geïnduceerde downregulatie kan worden gecompenseerd door synthese van nieuwe receptoren. Onder deze omstandigheden kan de downregulatie van de receptor zwembad in plaats worden bepaald door middel van metabolisch merken en pulse-chase experimenten beschreven 21. Alternatief gejodeerde antilichamen (bij voorkeur Fc-fragmenten) die niet interfereren met receptor binding kan worden gebruikt om "tag" het ectodomein van het receptof, en de verwachte verlaagde expressie kan vervolgens worden bepaald door radioactieve telling van celpellet en medium.
Om logistieke redenen getransfecteerde we cellen met een construct die een CNTFRa Myc-tag, en in dit protocol een muis anti-Myc antilichaam werd gebruikt voor Western blot-detectie van de receptor. Daarentegen werd een geit anti-CNTFRa antilichaam gebruikt voor immunocytochemie en dubbele labeling als LAMP-1 werd gedetecteerd door een muizenantilichaam – en uiteraard het gebruik van twee primaire muizenantilichamen zou leiden tot niet-specifieke (overlappend) kleuring met secundaire antilichamen. Merk op dat aangezien de geit anti-CNTFRa werkt ook in Western blotting (niet getoond), het protocol kan gemakkelijk worden aangepast en toegepast op cellen die met niet-gecodeerde CNTFRa.
Tenslotte is onlangs aangetoond dat ook de endocytische receptor bindt sortilin CLC: CLF-1 met hoge affiniteit 22. Zo is het denkbaar dat sortilin, zoalssorLA, interconnects naar CLC: CNTFRa via CLF-1 en is in staat om endocytose en lysosomale targeting van CNTFRa ook bemiddelen. Met behulp van sortilin in plaats van sorLA kan het onderhavige protocol worden gebruikt om deze vraag te verduidelijken.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
| 4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
| Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| Dulbecco Modified Eagle´s Medium | Lonza | BE12-604F/U1 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30028.02 | |
| CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
| Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
| Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
| Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
| Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
| Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
| Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
| Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
| Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
| Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
| Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
| Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
| Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
| Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
| Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
| Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
| EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
| cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
| LDS sample Buffer (4X) | Novex | NP0007 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 4% paraformaldehyde | VWR | 97,135,000 | |
| Saponin | Sigma | S7900-100G | |
| Mounting Media | Dako | S3023 |
References
- Elson, G. C., et al. CLF associates with CLC to form a functional heteromeric ligand for the CNTF receptor complex. Nat Neurosci. 3 (9), 867-872 (2000).
- Senaldi, G., et al. Novel neurotrophin-1/B cell-stimulating factor-3: a cytokine of the IL-6 family. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 11458-11463 (1999).
- Elson, G. C., et al. Cytokine-like factor-1, a novel soluble protein, shares homology with members of the cytokine type I receptor family. J Immunol. 161 (3), 1371-1379 (1998).
- Lelievre, E., et al. Signaling pathways recruited by the cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor-1 composite cytokine: specific requirement of the membrane-bound form of ciliary neurotrophic factor receptor alpha component. J Biol Chem. 276 (25), 22476-22484 (2001).
- Zou, X., et al. Neonatal Death in Mice Lacking Cardiotrophin-Like Cytokine (CLC) is Associated with Multifocal Neuronal Hypoplasia. Vet Pathol. 46 (3), 514-519 (2008).
- Forger, N. G., et al. Cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor 1 is an essential trophic factor for lumbar and facial motoneurons in vivo. J Neurosci. 23 (26), 8854-8858 (2003).
- Alexander, W. S., et al. Suckling defect in mice lacking the soluble haemopoietin receptor NR6. Curr Biol. 9 (11), 605-608 (1999).
- DeChiara, T. M., et al. Mice lacking the CNTF receptor, unlike mice lacking CNTF, exhibit profound motor neuron deficits at birth. Cell. 83 (2), 313-322 (1995).
- Crisponi, L., et al. Crisponi syndrome is caused by mutations in the CRLF1 gene and is allelic to cold-induced sweating syndrome type 1. Am J Hum Genet. 80 (5), 971-981 (2007).
- Crisponi, G. Autosomal recessive disorder with muscle contractions resembling neonatal tetanus, characteristic face, camptodactyly, hyperthermia, and sudden death: a new syndrome. Am J Med Genet. 62 (4), 365-371 (1996).
- Sohar, E., Shoenfeld, Y., Udassin, R., Magazanik, A., Revach, M. Cold-induced profuse sweating on back and chest. A new genetic entity. Lancet. 2 (8099), 1073-1074 (1978).
- Guillet, C., et al. Functionally active fusion protein of the novel composite cytokine CLC/soluble CNTF receptor. Eur J Biochem. 269 (7), 1932-1941 (2002).
- Larsen, J. V., et al. Cytokine-Like Factor 1, an Essential Facilitator of Cardiotrophin-Like Cytokine:Ciliary Neurotrophic Factor Receptor alpha Signaling and sorLA-Mediated Turnover. Mol Cell Biol. 36 (8), 1272-1286 (2016).
- Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors – regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
- Jacobsen, L., et al. Molecular characterization of a novel human hybrid-type receptor that binds the alpha2-macroglobulin receptor-associated protein. J Biol Chem. 271 (49), 31379-31383 (1996).
- Nielsen, M. S., et al. Sorting by the cytoplasmic domain of the amyloid precursor protein binding receptor SorLA. Mol Cell Biol. 27 (19), 6842-6851 (2007).
- Jacobsen, L., et al. The sorLA cytoplasmic domain interacts with GGA1 and -2 and defines minimum requirements for GGA binding. FEBS Lett. 511 (1-3), 155-158 (2002).
- Klinger, S. C., et al. SorLA regulates the activity of lipoprotein lipase by intracellular trafficking. J Cell Sci. 124 (7), 1095-1105 (2011).
- Kitago, Y., et al. Structural basis for amyloidogenic peptide recognition by sorLA. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 199-206 (2015).
- Quistgaard, E. M., et al. Ligands bind to Sortilin in the tunnel of a ten-bladed beta-propeller domain. Nat Struct Mol Biol. 16 (1), 96-98 (2009).
- Larsen, J. V., et al. Human sorCS1 binds sortilin and hampers its cellular functions. Biochem J. 457 (2), 277-288 (2014).
- Larsen, J. V., et al. Sortilin facilitates signaling of ciliary neurotrophic factor and related helical type 1 cytokines targeting the gp130/leukemia inhibitory factor receptor beta heterodimer. Mol Cell Biol. 30 (17), 4175-4187 (2010).
