Le présent protocole décrit comment blot et immunocytochimie combinée à l'inhibition des enzymes lysosomales Western peut être utilisé pour démontrer la régulation négative de facteur neurotrophique ciliaire Receptor-α (CNTFRα), qui est transmis par l'interaction entre la cytokine-like Factor-1 (CLF-1 ) et le récepteur d'endocytose SORLA.
La cytokine hétérodimérique Cytokine Cardiotrophin-like: Cytokine-like Factor-1 (CLC: CLF-1) vise le glycosylphosphatidylinositol (GPI) -anchored CNTFRα pour former un complexe trimérique qui recrute ensuite glycoprotéine 130 / Leucémie facteur inhibiteur des récepteurs-β (gp130 / LIFRβ) pour la signalisation. Les deux CTC et CNTFRα sont nécessaires pour la signalisation, mais jusqu'à présent CLF-1 n'a été connu comme un facilitateur putative de la sécrétion CLC. Cependant, il a été montré récemment que CLF-1 contient trois sites de liaison: l'un pour la SIC; pour une CNTFRα (qui peut favoriser l'assemblage du complexe trimérique); et une pour le récepteur d'endocytose SORLA. Le dernier site fournit la liaison de la NSI-1, CLC haute affinité: CLF-1, ainsi que le trimère (CLC: CLF-1: CNTFRα) complexe à SORLA, et dans les cellules SORLA exprimant les ligands solubles NSI-1 et du CTC : CLF-1 sont rapidement repris et intériorisé. Dans les cellules co-exprimant CNTFRα et SORLA, CNTFRα lie premier CLC: CLF-1 pour formerun complexe trimérique associée à la membrane, mais il se connecte également à SORLA via le site gratuit de SORLA contraignant CLF-1. En conséquence, CNTFRα, qui n'a pas de capacité d'endocytose lui-même, est tira le long et internalisé par l'endocytose SORLA médiée CLC: CLF-1.
Le présent protocole décrit les procédures expérimentales utilisées pour démontrer i) le SORLA médiée et CLC: downregulation CLF-1 dépendante de l'expression CNTFRα surface de la membrane; ii) l'endocytose et le ciblage lysosomial de CNTFRα SORLA à médiation; et iii) la réponse cellulaire réduit à la SIC: CLF-1-stimulation sur la régulation négative SORLA médiée par des CNTFRα.
Le CTC et CLF-1 constituent les deux sous – unités de la cytokine CLC hétérodimère: NSI-1 de 1-3. Pour signal cellulaire induction, CLC: CLF-1 premières cibles du CNTFRα, son récepteur primaire et ancrée par GPI, pour former un complexe trimère lié à la membrane. Le CTC: CLF-1: complexe CNTFRα recrute ensuite gp130 / LIFRβ qui médie transmembranaire signalisation par Janus Kinase / Signal Transducteurs et activateurs de 3 Transcription (JAK / STAT3) de la voie 4. Les souris déficientes dans l' un des trois sous – unités afficher une seule et même phénotype et meurent dans les 24 heures après la naissance en raison d'un nombre réduit de neurones du visage et de lait insuffisante 5-8. Les résultats mettent en évidence chez les humains également la cohérence fonctionnelle des trois sous-unités. Ainsi, les mutations humaines (homozygotes ou composés) dysfonctionnement provoquant des CLC: CLF-1 ou CNTFRα, tout résultat dans la soi-disant transpiration induite par le froid / syndrome Crisponi, une condition caractérisée par des symptômes tels que impaitétée rouge et de la déglutition, diverses caractéristiques dysmorphiques, pointes de température, et paradoxale et perfuser la transpiration à basse température 9-11.
In vitro, la combinaison de la SIC et CNTFRα est à la fois nécessaire et suffisante pour l' interaction avec gp130 / LIFRβ et l'induction de la signalisation dans les cellules 12. Le rôle de la NSI-1 d'autre part est moins claire. Il est pas directement impliqué dans la signalisation, et a longtemps été considéré comme une annexe qui sert principalement à faciliter la sécrétion cellulaire de CLC 1. Cependant, les résultats récents montrent que la NSI-1 a des fonctions supplémentaires et plus importants impliquant à la fois la signalisation et le chiffre d'affaires du CTC et CNTFRα. Ainsi, il apparaît que la NSI-1 contient trois sites de liaison indépendants: l'un pour son bien connu de liaison à la SIC; qui médie la liaison directe à l'CNTFRα; et un troisième site (haute affinité) pour l'interaction avec le récepteur d'endocytose SORLA. Comme les deux CTC et CLF-1 semblent & #160; pour cibler CNTFRα avec une faible affinité considérable que le CTC: complexe CLF-1, il est concevable que la NSI-1 (via son site de liaison CNTFRα) favorise l'unification du CTC et CNTFRα et facilite ainsi la signalisation 13.
l'interaction de la NSI-1 avec SORLA, la question principale de la présente présentation, joue un rôle complètement différent. SORLA est l' un des cinq type 1 des récepteurs qui constituent la famille des récepteurs Vps10p domaine 14. Elle est exprimée dans une variété de tissus , mais en particulier dans le cerveau et dans les tissus neuronaux 15. SORLA similaire aux autres membres de la famille porte une liaison à Vps10p domaine ligand N-terminal, mais en plus, elle comprend également d' autres types de domaines , y compris les éléments de liaison de ligand trouvée dans les membres de la famille des récepteurs de lipoprotéine de basse densité 15. Sa queue cytoplasmique interagit avec plusieurs protéines adaptatrices, par exemple, un adaptateur protéine-1 et -2, et transmet SORLA efficaces endocytosest ainsi que le tri intracellulaire et le transport des protéines liées 16-18. Le Vps10p domaine comprend un grand β-hélice dix lames 19,20, qui se lie à une série de ligands non apparentés , y compris la NSI-1 (mais notamment, pas CTC) 13. Le site de liaison de la NSI-1 est accessible même après la formation du complexe avec la SIC et CNTFRα qui signifie que SORLA lie non seulement libre CLF-1, mais aussi CLC: CLF-1 et le CTC complexe trimère: CLF-1: CNTFRα 13. SORLA transmet endocytose rapide de CLF-1 et CLC: CLF-1, mais ceux-ci sont des protéines solubles alors CNTFRα est fixée à la membrane de surface par une ancre GPI. La question est donc si obligatoire du CLC: CLF-1: CNTFRα permet SORLA d'internaliser l'ensemble du complexe et par conséquent de modifier l'expression de surface de la membrane de CNTFRα (et la sensibilité cellulaire subséquente à la SIC: CLF-1 Signal induction), et / ou le chiffre d'affaires de CNTFRα.
Les expériences décrites dans le présentrapport ont été conçues pour clarifier les questions suivantes:
Est-ce que la médiation SORLA CLC: downregulation CLF-1-dépendante de la surface de la membrane CNTFRα? Pour clarifier ce point , il a été d' abord tenté de déterminer le chiffre d'affaires de CNTFRα (en l'absence et la présence de SORLA) au moyen d'expériences de marquage et de pulse-chase métaboliques comme décrit dans 21. Cependant, les tentatives pour étiqueter CNTFRα utilisant un mélange de [35 S] cystéine et [S 35] méthionine présentait une mauvaise incorporation de la radioactivité. Cela suggère un degré très faible d'une nouvelle synthèse, qui, selon toute probabilité serait incapable de compenser une perte soudaine et importante des récepteurs. Pour déterminer si CNTFRα a été downregulated lorsqu'ils sont interconnectés via CLC: CLF-1 à SORLA, il a donc été décidé tout simplement de mesurer (en utilisant Western blot) la piscine cellulaire total de CNTFRα avant et après exposition à la SIC: CLF-1 – et de comparer les résultats dans des cellules transfectées ou non transfectées parSORLA.
Est-ce que SORLA cible CNTFRα à lysosomes? Pour répondre à cette question, la localisation de CNTFRα – internalisé via son CLC: CLF-1 médiée par la liaison à SORLA – a été examinée en utilisant immunocytochimie, et l'étiquetage avec des anticorps dirigés vers CNTFRα et la fin-endosome / lysosome marqueur lysosomale associée Membrane Protein 1 (LAMP-1). L'expérience a été réalisée sur des cellules traitées et non traitées avec des inhibiteurs d'enzymes lysosomales. L'idée était bien sûr que si CNTFRα a été dégradé dans les lysosomes, les cellules traitées avec des enzymes inhibiteurs présenteraient CNTFRα-coloration accumuler dans LAMP-1 vésicules positives, alors que les cellules non traitées montreraient peu ou pas de coloration pour CNTFRα.
Est-ce que CNTFRα downregulation abaisser la réponse cellulaire à la SIC: CLF-1 stimulation? Le complexe trimère constitué de CTC, CLF-1, et des signaux CNTFRα via le gp130 / hétérodimère LIFRβ utilisant le JAK / STAT3sentier. En conséquence, la capacité des cellules à répondre à la SIC: CLF-1 de signalisation sur la régulation négative de CNTFRα a été explorée par la détection par Western blot et la quantification du niveau de STAT3 phospho-STAT3 (pSTAT3) / total dans transfectants SORLA.
Le protocole décrit ici peut être utilisé spécifiquement pour démontrer le CTC SORLA médiée: downregulation CLF-1-dépendante et de ciblage lysosomial de CNTFRα, ainsi que la réponse affaiblie accompagnant à la SIC: CLF-1 stimulation.
La lignée cellulaire HEK293 est bien adapté pour ce protocole, car ils ont seulement une expression endogène mineure de CNTFRα et SORLA, sont faciles à transfecter, expresse gp130 / LIFRβ, et ont un corps à grandes cellules, qui est adapté pour immunocytochimie. Cependant, en théorie toute lignée cellulaire ayant des propriétés similaires devrait fonctionner aussi bien.
Le protocole comporte deux étapes essentielles. La première concerne l'étape 2.3, dans lequel le / moyen de pep de leu doit être remplacé environ tous les 6 h pendant 24 h. Le non-respect peut entraîner des enzymes lysosomales actives et moins ou pas d'accumulation détectable de protéines dans les lysosomes. La deuxième étape critique (3.4) des préoccupations de lavage à pré-incubation avec CLC: CLF-1. Il est important pour éliminer tout ligand non lié, et de laisser le temps aux cellules de récupérer (en évitant la stimulation continue) dans DMEM non supplémenté (support vierge). Cela permettra d'assurer un faible niveau de fond de pSTAT3 pendant la re-stimulation ultérieure avec CLC: CLF-1 (étape 3.5).
En particulier, la figure 6 montre que la réponse cellulaire (pSTAT3) diminue en parallèle avec la régulation à la baisse médiée par SORLA de CNTFRα. Il convient de souligner toutefois que si une réponse réduite est en conformité avec (et à prévoir sur) une réduction de la piscine CNTFRα, cela ne prouve pas que la faible expression CNTFRα représente à lui seul la réponse cellulaire réduite. Ainsi, les changements résultant de – pré-stimulation ou la transfection – dans l'un des éléments fonctionnels de la voie de signalisation de l'amont vers l'pSTAT3 peuvent avoir contribué à la réponse modifiée.
Le concept de base du protocole ne se limite pas à cette particuSystème de récepteur LAR. (. -À- dire une autre lignée cellulaire, d' autres anticorps, d' autres ligands, etc.) en modifiant le protocole , il peut être utilisé pour déterminer la régulation négative induite par un ligand d'autres récepteurs ainsi que – indépendamment de la participation sorLA's. Toutefois, il convient de noter que l' analyse du récepteur de régulation à la baisse par Western Blot est principalement adaptée à des récepteurs, par exemple des récepteurs GPI, qui présentent une rotation lente et un faible degré de nouvelle synthèse dans des cellules non stimulées. Ainsi, dans les récepteurs présentant un niveau élevé de nouvelle synthèse, la régulation négative induite par le ligand peut être compensée par la synthèse de nouveaux récepteurs. Dans ces conditions, la régulation négative de la piscine du récepteur peut plutôt être déterminé au moyen d'expériences de marquage et de pulse-chase métaboliques comme décrit dans le 21. En variante, les anticorps iodés (de préférence Fc fragments) qui ne gênent pas la liaison au récepteur peuvent être utilisés pour "tag" l'ectodomaine de la receptou, et la régulation à la baisse attendue peut être ensuite déterminé par comptage radioactif du culot cellulaire et moyenne.
Pour des raisons logistiques, nous transfecté nos cellules avec un CNTFRα construire portant un Myc-tag, et dans le présent protocole d'un anticorps anti-Myc souris a été utilisée pour blot de détection Western du récepteur. En revanche, un anticorps anti-chèvre CNTFRα a été utilisé pour immunocytochimie et un double marquage a été détectée comme LAMP-1 par un anticorps de souris – et l'utilisation de toute évidence de deux anticorps primaires de souris entraînerait non spécifique (chevauchement) coloration avec des anticorps secondaires. A noter que, puisque la chèvre anti-CNTFRα fonctionne également en transfert de Western (non représenté), le protocole peut être facilement modifiée et appliquée à des cellules transfectées avec CNTFRα non marqué.
Enfin, il a été récemment montré que aussi le sortiline récepteur d' endocytose lie CLC: CLF-1 avec une affinité élevée 22. Ainsi, il est concevable que la sortiline, commeSORLA, interconnexions à la SIC: CNTFRα via CLF-1 et est en mesure de servir de médiateur endocytose et ciblage lysosomal de CNTFRα ainsi. Utilisation de sortiline au lieu de SORLA, le présent protocole peut être utilisé pour clarifier cette question.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
Dulbecco Modified Eagle´s Medium | Lonza | BE12-604F/U1 | |
Fetal bovine serum | Thermo Scientific | 10270106 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
Dulbecco Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30028.02 | |
CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
LDS sample Buffer (4X) | Novex | NP0007 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
4% paraformaldehyde | VWR | 97,135,000 | |
Saponin | Sigma | S7900-100G | |
Mounting Media | Dako | S3023 |