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Biochemistry

SORLA et CLC: CLF-1 La régulation négative dépendant de CNTFRα tel que démontré par Western blot, Inhibition de lysosomale Enzymes et Immunocytochimie

Published: January 06, 2017
doi:
10.3791/55019
,
1Department of Biomedicine,Aarhus University

Summary

Le présent protocole décrit comment blot et immunocytochimie combinée à l'inhibition des enzymes lysosomales Western peut être utilisé pour démontrer la régulation négative de facteur neurotrophique ciliaire Receptor-α (CNTFRα), qui est transmis par l'interaction entre la cytokine-like Factor-1 (CLF-1 ) et le récepteur d'endocytose SORLA.

Abstract

La cytokine hétérodimérique Cytokine Cardiotrophin-like: Cytokine-like Factor-1 (CLC: CLF-1) vise le glycosylphosphatidylinositol (GPI) -anchored CNTFRα pour former un complexe trimérique qui recrute ensuite glycoprotéine 130 / Leucémie facteur inhibiteur des récepteurs-β (gp130 / LIFRβ) pour la signalisation. Les deux CTC et CNTFRα sont nécessaires pour la signalisation, mais jusqu'à présent CLF-1 n'a été connu comme un facilitateur putative de la sécrétion CLC. Cependant, il a été montré récemment que CLF-1 contient trois sites de liaison: l'un pour la SIC; pour une CNTFRα (qui peut favoriser l'assemblage du complexe trimérique); et une pour le récepteur d'endocytose SORLA. Le dernier site fournit la liaison de la NSI-1, CLC haute affinité: CLF-1, ainsi que le trimère (CLC: CLF-1: CNTFRα) complexe à SORLA, et dans les cellules SORLA exprimant les ligands solubles NSI-1 et du CTC : CLF-1 sont rapidement repris et intériorisé. Dans les cellules co-exprimant CNTFRα et SORLA, CNTFRα lie premier CLC: CLF-1 pour formerun complexe trimérique associée à la membrane, mais il se connecte également à SORLA via le site gratuit de SORLA contraignant CLF-1. En conséquence, CNTFRα, qui n'a pas de capacité d'endocytose lui-même, est tira le long et internalisé par l'endocytose SORLA médiée CLC: CLF-1.

Le présent protocole décrit les procédures expérimentales utilisées pour démontrer i) le SORLA médiée et CLC: downregulation CLF-1 dépendante de l'expression CNTFRα surface de la membrane; ii) l'endocytose et le ciblage lysosomial de CNTFRα SORLA à médiation; et iii) la réponse cellulaire réduit à la SIC: CLF-1-stimulation sur la régulation négative SORLA médiée par des CNTFRα.

Introduction

Le CTC et CLF-1 constituent les deux sous – unités de la cytokine CLC hétérodimère: NSI-1 de 1-3. Pour signal cellulaire induction, CLC: CLF-1 premières cibles du CNTFRα, son récepteur primaire et ancrée par GPI, pour former un complexe trimère lié à la membrane. Le CTC: CLF-1: complexe CNTFRα recrute ensuite gp130 / LIFRβ qui médie transmembranaire signalisation par Janus Kinase / Signal Transducteurs et activateurs de 3 Transcription (JAK / STAT3) de la voie 4. Les souris déficientes dans l' un des trois sous – unités afficher une seule et même phénotype et meurent dans les 24 heures après la naissance en raison d'un nombre réduit de neurones du visage et de lait insuffisante 5-8. Les résultats mettent en évidence chez les humains également la cohérence fonctionnelle des trois sous-unités. Ainsi, les mutations humaines (homozygotes ou composés) dysfonctionnement provoquant des CLC: CLF-1 ou CNTFRα, tout résultat dans la soi-disant transpiration induite par le froid / syndrome Crisponi, une condition caractérisée par des symptômes tels que impaitétée rouge et de la déglutition, diverses caractéristiques dysmorphiques, pointes de température, et paradoxale et perfuser la transpiration à basse température 9-11.

In vitro, la combinaison de la SIC et CNTFRα est à la fois nécessaire et suffisante pour l' interaction avec gp130 / LIFRβ et l'induction de la signalisation dans les cellules 12. Le rôle de la NSI-1 d'autre part est moins claire. Il est pas directement impliqué dans la signalisation, et a longtemps été considéré comme une annexe qui sert principalement à faciliter la sécrétion cellulaire de CLC 1. Cependant, les résultats récents montrent que la NSI-1 a des fonctions supplémentaires et plus importants impliquant à la fois la signalisation et le chiffre d'affaires du CTC et CNTFRα. Ainsi, il apparaît que la NSI-1 contient trois sites de liaison indépendants: l'un pour son bien connu de liaison à la SIC; qui médie la liaison directe à l'CNTFRα; et un troisième site (haute affinité) pour l'interaction avec le récepteur d'endocytose SORLA. Comme les deux CTC et CLF-1 semblent & #160; pour cibler CNTFRα avec une faible affinité considérable que le CTC: complexe CLF-1, il est concevable que la NSI-1 (via son site de liaison CNTFRα) favorise l'unification du CTC et CNTFRα et facilite ainsi la signalisation 13.

l'interaction de la NSI-1 avec SORLA, la question principale de la présente présentation, joue un rôle complètement différent. SORLA est l' un des cinq type 1 des récepteurs qui constituent la famille des récepteurs Vps10p domaine 14. Elle est exprimée dans une variété de tissus , mais en particulier dans le cerveau et dans les tissus neuronaux 15. SORLA similaire aux autres membres de la famille porte une liaison à Vps10p domaine ligand N-terminal, mais en plus, elle comprend également d' autres types de domaines , y compris les éléments de liaison de ligand trouvée dans les membres de la famille des récepteurs de lipoprotéine de basse densité 15. Sa queue cytoplasmique interagit avec plusieurs protéines adaptatrices, par exemple, un adaptateur protéine-1 et -2, et transmet SORLA efficaces endocytosest ainsi que le tri intracellulaire et le transport des protéines liées 16-18. Le Vps10p domaine comprend un grand β-hélice dix lames 19,20, qui se lie à une série de ligands non apparentés , y compris la NSI-1 (mais notamment, pas CTC) 13. Le site de liaison de la NSI-1 est accessible même après la formation du complexe avec la SIC et CNTFRα qui signifie que SORLA lie non seulement libre CLF-1, mais aussi CLC: CLF-1 et le CTC complexe trimère: CLF-1: CNTFRα 13. SORLA transmet endocytose rapide de CLF-1 et CLC: CLF-1, mais ceux-ci sont des protéines solubles alors CNTFRα est fixée à la membrane de surface par une ancre GPI. La question est donc si obligatoire du CLC: CLF-1: CNTFRα permet SORLA d'internaliser l'ensemble du complexe et par conséquent de modifier l'expression de surface de la membrane de CNTFRα (et la sensibilité cellulaire subséquente à la SIC: CLF-1 Signal induction), et / ou le chiffre d'affaires de CNTFRα.

Les expériences décrites dans le présentrapport ont été conçues pour clarifier les questions suivantes:

Est-ce que la médiation SORLA CLC: downregulation CLF-1-dépendante de la surface de la membrane CNTFRα? Pour clarifier ce point , il a été d' abord tenté de déterminer le chiffre d'affaires de CNTFRα (en l'absence et la présence de SORLA) au moyen d'expériences de marquage et de pulse-chase métaboliques comme décrit dans 21. Cependant, les tentatives pour étiqueter CNTFRα utilisant un mélange de [35 S] cystéine et [S 35] méthionine présentait une mauvaise incorporation de la radioactivité. Cela suggère un degré très faible d'une nouvelle synthèse, qui, selon toute probabilité serait incapable de compenser une perte soudaine et importante des récepteurs. Pour déterminer si CNTFRα a été downregulated lorsqu'ils sont interconnectés via CLC: CLF-1 à SORLA, il a donc été décidé tout simplement de mesurer (en utilisant Western blot) la piscine cellulaire total de CNTFRα avant et après exposition à la SIC: CLF-1 – et de comparer les résultats dans des cellules transfectées ou non transfectées parSORLA.

Est-ce que SORLA cible CNTFRα à lysosomes? Pour répondre à cette question, la localisation de CNTFRα – internalisé via son CLC: CLF-1 médiée par la liaison à SORLA – a été examinée en utilisant immunocytochimie, et l'étiquetage avec des anticorps dirigés vers CNTFRα et la fin-endosome / lysosome marqueur lysosomale associée Membrane Protein 1 (LAMP-1). L'expérience a été réalisée sur des cellules traitées et non traitées avec des inhibiteurs d'enzymes lysosomales. L'idée était bien sûr que si CNTFRα a été dégradé dans les lysosomes, les cellules traitées avec des enzymes inhibiteurs présenteraient CNTFRα-coloration accumuler dans LAMP-1 vésicules positives, alors que les cellules non traitées montreraient peu ou pas de coloration pour CNTFRα.

Est-ce que CNTFRα downregulation abaisser la réponse cellulaire à la SIC: CLF-1 stimulation? Le complexe trimère constitué de CTC, CLF-1, et des signaux CNTFRα via le gp130 / hétérodimère LIFRβ utilisant le JAK / STAT3sentier. En conséquence, la capacité des cellules à répondre à la SIC: CLF-1 de signalisation sur la régulation négative de CNTFRα a été explorée par la détection par Western blot et la quantification du niveau de STAT3 phospho-STAT3 (pSTAT3) / total dans transfectants SORLA.

Protocol

1. Western blot de lysats CNTFRα Exprimez pleine longueur SORLA et Myc marqués CNTFRα constructions dans le rein embryonnaire humain 293 (HEK293) cellules en utilisant pcDNA3.1 / Zeo (-) et pcDNA3.1 / hyg (-), respectivement. Transfecter les cellules HEK293 avec les constructions en utilisant un réactif de transfection du commerce, selon le protocole Référence rechange. Sélectionnez clones stables dans un milieu contenant 150 pg / ml de Zéocine et / ou 500 pg / ml d' hygromycine B Or 13. Un nombre égal de plants HEK293 transfectées exprimant soit CNTFRα-Myc ou co-exprimant CNTFRα-Myc / SORLA dans deux plaques 4 puits comme le montre la figure 1. La culture des cellules dans Eagle's Dulbecco modifié (DMEM) additionné de 10% du foetus sérum bovin (FBS), 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine (milieu complet) dans un incubateur à dioxyde de carbone à 5% à 37 ° C. Attendez jusqu'à ce que les cellules sont 50 – 80% de confluence. Retirez le support de lapuits, laver une fois avec Dulbecco saline tamponnée au phosphate (DPBS), et ajouter plein milieu frais avec ou sans (témoin) 10 nM CLC: CLF-1 comme indiqué sur la figure 1. Incuber les cellules à 37 ° C. Après 0 et 5 h d'incubation, de récupérer le moyen et le stocker à 4 ° C dans des tubes de 1,5 mL. Puis ajouter 1% de tampon Triton X-100 lyse (20 mM Tris-HCl, 10 mM d'EDTA, pH 8,0) additionné d'un cocktail d'inhibiteurs de proteinases à chaque puits (1 min, 4 ° C). Par la suite, le transfert des lysats cellulaires à des tubes de 1,5 ml (4 c). Faites tourner les tubes contenant le milieu et lysat cellulaire (3000 xg, 3 min, 4 ° C) et transférer les surnageants dans des tubes de 1,5 ml (4 c). Jeter le culot. Transfert 5 pi de chaque lysat cellulaire surnageant à de nouveaux tubes de 1,5 mL – les utiliser pour mesurer la teneur en protéines plus tard (étape 1.7). Immédiatement, ajouter non réductrices tampon d'échantillon LDS à tous les surnageants et vortexer les échantillons. Utilisez les 5 aliquotes uL pour mesurer la protein contenu dans les surnageants du lysat cellulaire en utilisant un dosage de protéine du commerce, selon le protocole du fabricant. Chauffer les échantillons à 95 ° C pendant 5 min. Sujet d' une quantité égale de protéine de chaque échantillon de SDS-PAGE réducteur 13 et transfert de Western 13 et de visualiser le contenu de SORLA, β-actine et CNTFRα-Myc dans le milieu et dans les lysats cellulaires en utilisant de lapin anti-SORLA 16 (5 ug / ml), de souris anti-β-actine (0,4 pg / ml) et de souris anti-Myc (1 pg / ml) d'anticorps et les anticorps secondaires appropriés HRP liés (1: 2000). Quantifier les bandes par densitométrie selon le protocole du fabricant. 2. Immunocytochimie en association avec des inhibiteurs lysosomales Semence des cellules HEK293 transfectées de façon stable avec CNTFRα-Myc / SORLA sur des lamelles de couverture dans une plaque 4 ainsi que représenté sur la figure 2. Culture des cellules dans un milieu complet comme ci-dessus. Attendez jusqu'à ce que la confluence des cellules est 20 – 40%. Retirer le moyen des puits et ajouter du milieu complet avec ou sans 50 pg / ml de leupeptine et de pepstatine A (leu / pep) (inhibe les hydrolases lysosomales) aux cellules comme indiqué dans la figure 2. Incuber les cellules à 37 ° C. Le milieu doit être remplacé tous les 6 h pendant les 24 heures d'incubation suivantes. Après 24 h d'incubation, remplacer à nouveau le moyen (avec ou sans leu / pep) et cette fois ajouter 10 nM CLC: CLF-1. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 h. Laver les cellules une fois dans du PBS et les fixer à 4% de paraformaldehyde, pH 7 pendant 15 min à température ambiante. Attention: paraformaldéhyde est très toxique, éviter tout contact avec la peau, les yeux et les muqueuses. Gants et lunettes de sécurité doivent être portés et des solutions faites à l'intérieur d'une hotte. Laver les cellules une fois dans du PBS et perméabiliser les cellules pendant 5 min à température ambiante dans saponine dilué dans du PBS (0,5% de saponine). Diluer chèvre anti-CNTFRα (1 pg / ml) (en particulierpas de souris anti-Myc transfert de Western) et la souris des anticorps anti-LAMP-1 (15 ug / ml) dans 0,5% de saponine et incuber les cellules avec les anticorps pendant 2 heures à température ambiante. Laver les cellules 4x (5 min) dans 0,5% de saponine et on incube les cellules avec un âne anti-chèvre Alexa 488- et d'âne anti-souris, Alexa 568 Anticorps secondaires conjugués (6 pg / ml) pendant 2 h à température ambiante. Laver les cellules 4x (5 min) dans 0,5% de saponine, deux fois dans de l'eau déminéralisée (1 min), et monter les diapositives de couverture sur les lames de microscope à l'aide de supports de montage. Analyser l'anticorps-coloration des cellules par microscopie confocale en utilisant un microscope confocal laser à balayage avec un objectif à immersion d'eau 63X C-apochromat, NA 1.2. 3. Western Blot-détection du niveau pSTAT3 Semence des cellules HEK293-SORLA (qui expriment des taux endogènes de CNTFRα) dans une plaque 4 ainsi que représenté sur la figure 3. Culture des cellules dans un milieu complet comme ci-dessus. Attendez que leles cellules sont 50 – 80% confluentes. Retirer le moyen des puits, laver une fois dans du PBS, et ajouter du milieu complet frais avec ou sans 10 nM CLC: CLF-1 aux cellules comme indiqué dans la figure 3. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 h. Retirer le milieu, laver les cellules deux fois dans DMEM non supplémenté (support vierge, sans FBS et des antibiotiques), puis réincuber les cellules pendant 90 minutes (37 ° C) dans un milieu vierge. Encore une fois, éliminer le milieu et ajouter du milieu blanc frais avec ou sans 5 nM CLC: CLF-1 (pour initier STAT3 phosphorylation) comme indiqué dans la figure 3. Incuber pendant 15 min à 37 ° C. enlever rapidement le milieu et lyser les cellules (1 min, 4 ° C) par addition de 1% de tampon de lyse Triton X-100 (20 mM de Tris-HCI, EDTA, pH 8,0 10) complété par un cocktail d'inhibiteurs de proteinase et d'un inhibiteur de phosphatase cocktail à chaque puits. Par la suite, le transfert des lysats cellulaires à des tubes de 1,5 ml (4 c). Transfert 5 pi of chaque surnageant à de nouveaux tubes de 1,5 mL – les utiliser pour mesurer la teneur en protéines plus tard (étape 3.8). Immédiatement, ajouter non réductrices tampon d'échantillon LDS à tous les surnageants et vortexer les échantillons. Mesurer la teneur en protéines des fractions aliquotes de 5 ul en utilisant un dosage de protéine du commerce, selon le protocole du fabricant. Soniquer chaque échantillon à température ambiante jusqu'à ce qu'ils ne sont plus visqueux (environ 1 min) et par la suite sont les chauffer à 95 ° C pendant 5 min. Sujet d' une quantité égale de protéine de chaque échantillon de SDS-PAGE 13 et transfert de Western 13 et de visualiser le contenu de pSTAT3 et STAT3 totale dans les lysats cellulaires en utilisant de lapin anti-pSTAT3 (1: 2000) et de souris anti-STAT3 (1: 1000 ) les anticorps et les souris et de lapin HRP liés anticorps secondaires appropriés (1: 2000). Quantifier les bandes par densitométrie selon le protocole du fabricant.

Representative Results

La figure 1 montre une représentation schématique de la cellule-ensemencement et CLC: CLF-1 incubation dans le protocole 1. La figure 2 montre une représentation schématique de la cellule-ensemencement et leu / pep et CLC: CLF-1 incubation dans le protocole 2. Figure 3 montre une représentation schématique de la cellule-ensemencement et CLC: CLF-1 incubation et de stimulation dans le protocole 3. la figure 4 montre le CTC SORLA médiée: downregulation CLF-1-dépendante de CNTFRα. La figure 5 montre l'endocytose et lysosomale SORLA à médiation par le ciblage de CNTFRα. La figure 6 montre la réponse inférieure à la SIC: CLF-1 stimulation après CNTFRα downregulation. Notez que les bandes signifiant CNTFRα-Myc ont une densité similaire au temps zéro, alors que la régulation négative de CNTFRα-Myc est démontrée par la bande plus faible dans transfectants SORLA AFTEr 5 h (figure 4). La figure 5 montre que CNTFRα-Myc a accumulée dans LAMP-1 vésicules positives de cellules / leu pep traité. En revanche, aucune accumulation de CNTFRα-myc est observée dans les cellules non soumises à un traitement leu / pep. Cela démontre que CNTFRα-Myc est triée à lysosomes et dégradé. Comme on peut le voir sur la figure 6, le niveau de pSTAT3 est significativement réduite dans les cellules pré-stimulées par rapport au niveau dans les cellules qui n'a pas été exposée à la SIC: CLF-1. Ceci est en accord avec la régulation à la baisse observée SORLA à médiation CNTFRα dans les cellules pré-stimulées (figure 4). Figure 1: Représentation schématique de la cellule-ensemencement et du CTC: CLF-1 incubation dans le protocole 1. Seed cellules HEK293-CNTFRα-Myc et HEK293-CNTFRα-Myc / SORLA en deux 4-et plaques (0 et 5 h) et incuber les cellules avec CLC: CLF-1 comme indiqué. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2: Représentation schématique de la cellule-ensemencement et leu / pep et CLC: CLF-1 incubation dans le protocole 2. Seed cellules HEK293-CNTFRα-Myc / SORLA sur des lames de couverture dans une plaque de 4 puits et incuber les cellules avec ou sans leu / pep et CLC: CLF-1 comme indiqué. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3: </strong> Représentation schématique de la cellule-ensemencement et CLC: CLF incubation et de stimulation dans le protocole 3. Seed cellules HEK293-SORLA dans une plaque de 4 puits et incuber les cellules avec ou sans CLC: (. pré-exp) CLF-1 à réguler négativement la CNTFRα suivie par la SIC: CLF-1 stimulation (. de stim) pour initier STAT3 phosphorylation comme indiqué. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4: Résultats montrant que SORLA médiatise CLC: downregulation CLF-1-dépendante de CNTFRα. (A) HEK293-CNTFRα-Myc et des cellules (B) HEK293-CNTFRα-Myc / SORLA ont été mises en incubation en l'absence (colonnes blanches) ou en présence (colonnes grises) de 10 nm CTC: CLF-1. Après 0 et5 heures, l'incubation a été arrêtée et le contenu de CNTFRα-Myc dans le milieu (m) et dans les lysats cellulaires (L) a été détectée par Western Blot et quantifiés par densitométrie. Les panneaux supérieurs présentent des résultats provenant d'expériences Western Blot représentatifs et les panneaux inférieurs montrent les niveaux détectés de CNTFRα-Myc trouvés dans les lysats cellulaires. Les niveaux sont indiqués par rapport au niveau CNTFRα-Myc dans les transfectants simples et doubles à 0 h. Chaque colonne représente la moyenne ± SEM (n = 3). p-valeurs calculées à l'aide du test t. Reproduit après figure originale 13. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 5:Résultats montrant que SORLA médiatise endocytose et ciblage lysosomal de CNTFRα. cellules HEK293-CNTFRα-Myc / SORLA ont été traités avec ou sans leu / pep, incubées avec 10 nM CLC: CLF-1 pour 5 h, fixe, et enfin colorées utilisant des anticorps anti-CNTFRα et anti LAMP-1 anticorps tels que décrits dans le protocole 2. barres d'échelle: 5 um. Reproduit après figure originale 13. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 6: régulation à la baisse médiée par SORLA de CNTFRα est accompagnée d'une réponse cellulaire réduit au CTC: CLF-1 de stimulation. cellules HEK293-SORLA ont été pré-incubées en l'absence ou en présence de 10 nM CLC: (. pré-exp) CLF-1 pendant 5 h, affamés dans blanmoyen k pendant 90 min, et stimulées avec 5 nM CLC: (. stim) CLF-1 pendant 15 min. ( À gauche) Les colonnes indiquent les niveaux relatifs de pSTAT3 dans les cellules. Chaque colonne représente la moyenne ± SEM (n = 3) par rapport au niveau pSTAT3 dans les cellules préincubées en l'absence de CLC: NSI-1, mais stimulées avec CLC: NSI-1. p-valeur calculée à l'aide du test t. ( À droite) Le Western blot montre la réponse de pSTAT3 et STAT3 obtenu dans une expérience représentative. Reproduit après figure originale 13. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Le protocole décrit ici peut être utilisé spécifiquement pour démontrer le CTC SORLA médiée: downregulation CLF-1-dépendante et de ciblage lysosomial de CNTFRα, ainsi que la réponse affaiblie accompagnant à la SIC: CLF-1 stimulation.

La lignée cellulaire HEK293 est bien adapté pour ce protocole, car ils ont seulement une expression endogène mineure de CNTFRα et SORLA, sont faciles à transfecter, expresse gp130 / LIFRβ, et ont un corps à grandes cellules, qui est adapté pour immunocytochimie. Cependant, en théorie toute lignée cellulaire ayant des propriétés similaires devrait fonctionner aussi bien.

Le protocole comporte deux étapes essentielles. La première concerne l'étape 2.3, dans lequel le / moyen de pep de leu doit être remplacé environ tous les 6 h pendant 24 h. Le non-respect peut entraîner des enzymes lysosomales actives et moins ou pas d'accumulation détectable de protéines dans les lysosomes. La deuxième étape critique (3.4) des préoccupations de lavage à pré-incubation avec CLC: CLF-1. Il est important pour éliminer tout ligand non lié, et de laisser le temps aux cellules de récupérer (en évitant la stimulation continue) dans DMEM non supplémenté (support vierge). Cela permettra d'assurer un faible niveau de fond de pSTAT3 pendant la re-stimulation ultérieure avec CLC: CLF-1 (étape 3.5).

En particulier, la figure 6 montre que la réponse cellulaire (pSTAT3) diminue en parallèle avec la régulation à la baisse médiée par SORLA de CNTFRα. Il convient de souligner toutefois que si une réponse réduite est en conformité avec (et à prévoir sur) une réduction de la piscine CNTFRα, cela ne prouve pas que la faible expression CNTFRα représente à lui seul la réponse cellulaire réduite. Ainsi, les changements résultant de – pré-stimulation ou la transfection – dans l'un des éléments fonctionnels de la voie de signalisation de l'amont vers l'pSTAT3 peuvent avoir contribué à la réponse modifiée.

Le concept de base du protocole ne se limite pas à cette particuSystème de récepteur LAR. (. -À- dire une autre lignée cellulaire, d' autres anticorps, d' autres ligands, etc.) en modifiant le protocole , il peut être utilisé pour déterminer la régulation négative induite par un ligand d'autres récepteurs ainsi que – indépendamment de la participation sorLA's. Toutefois, il convient de noter que l' analyse du récepteur de régulation à la baisse par Western Blot est principalement adaptée à des récepteurs, par exemple des récepteurs GPI, qui présentent une rotation lente et un faible degré de nouvelle synthèse dans des cellules non stimulées. Ainsi, dans les récepteurs présentant un niveau élevé de nouvelle synthèse, la régulation négative induite par le ligand peut être compensée par la synthèse de nouveaux récepteurs. Dans ces conditions, la régulation négative de la piscine du récepteur peut plutôt être déterminé au moyen d'expériences de marquage et de pulse-chase métaboliques comme décrit dans le 21. En variante, les anticorps iodés (de préférence Fc fragments) qui ne gênent pas la liaison au récepteur peuvent être utilisés pour "tag" l'ectodomaine de la receptou, et la régulation à la baisse attendue peut être ensuite déterminé par comptage radioactif du culot cellulaire et moyenne.

Pour des raisons logistiques, nous transfecté nos cellules avec un CNTFRα construire portant un Myc-tag, et dans le présent protocole d'un anticorps anti-Myc souris a été utilisée pour blot de détection Western du récepteur. En revanche, un anticorps anti-chèvre CNTFRα a été utilisé pour immunocytochimie et un double marquage a été détectée comme LAMP-1 par un anticorps de souris – et l'utilisation de toute évidence de deux anticorps primaires de souris entraînerait non spécifique (chevauchement) coloration avec des anticorps secondaires. A noter que, puisque la chèvre anti-CNTFRα fonctionne également en transfert de Western (non représenté), le protocole peut être facilement modifiée et appliquée à des cellules transfectées avec CNTFRα non marqué.

Enfin, il a été récemment montré que aussi le sortiline récepteur d' endocytose lie CLC: CLF-1 avec une affinité élevée 22. Ainsi, il est concevable que la sortiline, commeSORLA, interconnexions à la SIC: CNTFRα via CLF-1 et est en mesure de servir de médiateur endocytose et ciblage lysosomal de CNTFRα ainsi. Utilisation de sortiline au lieu de SORLA, le présent protocole peut être utilisé pour clarifier cette question.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have no acknowledgements.

Materials

Zeocin InvivoGen ant-zn-1
Hygromycin B Gold InvivoGen ant-hg-1
FuGENE 6 Transfection Reagent  Roche 11 815 091 001
4-well plates (Nunclon Delta Surface) Thermo Scientific 176740
Safe-Lock tubes Eppendorf 0030 120.086
Dulbecco Modified Eagle´s Medium Lonza BE12-604F/U1
Fetal bovine serum Thermo Scientific 10270106
Penicillin-Streptomycin Thermo Scientific 15140122
Dulbecco Phosphate Buffered Saline  HyClone SH30028.02
CLC:CLF-1 R&D Systems 1151-CL/CF
Mouse anti-LAMP-1  DSHP H4A3
Rabbit anti-sorLA Reference 16
Mouse anti-b-actin  Sigma A2228
Mouse anti-Myc Genscript A00704
Goat anti-CNTFRa  R&D Systems AF-303
Rabbit anti-pSTAT3  Cell signaling Technology 9145s
Mouse anti-STAT3  Cell signaling Technology 9139s
Anti-mouse HRP-linked antibody Cell signaling Technology 7076s
Anti-rabbit HRP-linked antibody Cell signaling Technology 7074s
Anti-goat HRP-linked antibody Dako P0160
Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen A11055
Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate Invitrogen A10037
Leupeptin Sigma L8511-5MG
Pepstatin A  Sigma P4265-5MG
Triton X-100  AppliChem A1388
Tris-HCl Merck 1,082,191,000
EDTA:Titriplex III Merck 1,084,180,250
cOmplete mini EDTA-free Roche 11836170001
PhosSTOP Roche 04 906 837 001
LDS sample Buffer (4X)  Novex NP0007
Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad 500-0006
4% paraformaldehyde VWR 97,135,000
Saponin Sigma S7900-100G
Mounting Media Dako S3023
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References

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Larsen, J. V., Petersen, C. M. SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRα as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry. J. Vis. Exp. (119), e55019, doi:10.3791/55019 (2017).
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