ACT-PRESTO(器官への巨大分子のアクティブな明快技術-圧力関連の効率的かつ安定した転送)は、受動拡散または圧力補助送達によるクリア組織への、迅速、効率的な、しかし、安価な組織清算および迅速な抗体の浸透を可能にします。この方法を使用して、組織の広い範囲は、クリア複数の抗体によって免疫標識、および体積画像化することができます。
細胞レベルでの臓器の詳細な組織または全身の同定および探査は、生物学における基本的な課題です。移行方法は、三次元画像を得るために時間と労力のかなりの量を必要とし、無傷の組織、免疫標識、およびプロセスの各段階における情報の損失を生成する撮像直列切片組織を切片を含みます。無傷の組織内の高分解能イメージングのための最近開発された手法では、分子の特徴付けは、タンパク質の標識に制限されています。しかし、臓器をクリアするための現在利用可能なプロトコルは、それが困難な実験室での組織のクリア技術を実装すること、かなり長い処理時間を必要とします。我々は最近、迅速かつ再現性の高いプロトコルは、ACT-PRESTO ransfer トン (A ctive C larity トン echnique- のp ressure rの高揚電子の fficientとsテーブルと呼ばれる確立しました数時間以内に組織クリアランスを可能にする入出力 rgansへの巨大分子)、の。また、ACT-PRESTOは、従来の方法で迅速な免疫標識を可能にし、圧力または対流の流れを適用することにより、高密度に形成され、厚さの試験片の深い層への抗体の浸透を加速させます。私たちは、電気泳動を用いて脂質を除去することによってクリアする方法を組織し、準備する方法を説明し、方法圧力補助送達によって免疫染色します。プロトコルの迅速性と一貫性は、3D組織学的研究とボリュームベースの診断のパフォーマンスを促進します。
神経科学における課題の一つは、神経回路配線と、無傷の脳組織内の個々の細胞の視覚化です。最近まで、このようにニューロン間の接続を実証するには、組織の1)連続切片を必要と。このような軸索やタンパク質などの具体的な目標、の2)分子の標識。計算登録または2Dシリアル画像1のアライメントを経由して脳全体の3D再構成によると、3)可視化。これらの手順は、手間がかかる多大な時間を必要とし、神経細胞のネットワークマッピングが極めて困難にし、切片およびラベリング中に情報を失うおそれがあります。しかし、切片なしで無傷の組織の可視化を可能にする多くの方法が開発されています。生物組織は、組織透明技術2-10により、光学的に透明にすることができます。主要な方法の一つは、順番に、無傷の組織と浸漬液との間の屈折率の差を低減することですこのように透明な組織をレンダリングし、深部構造の観察を可能にする、無傷の組織内での光散乱を低減することができます。浸漬溶液の種類によっては、脱水過程中に高速の蛍光クエンチングをもたらす疎水性を有しています。したがって、これらの方法は、時間11,12の長い期間にわたって蛍光イメージングと互換性がありません。代わりに疎水性試薬の、他の方法は、生体組織の4,6,8の構造情報と蛍光を維持SeeDB 4とのSca リットル電子 6、のような組織をクリアするための親水性試薬を使用しています。ただし、巨大分子は、抗体を含む、拡散のみによって無傷組織のコアに到達することはできません。したがって、稠密組織の深部領域における標的分子の前標識は技術的に困難です。
最近開発された組織クリア方法では、CLARITY 3、ハイドロゲル包埋生体組織の私アクリルアミド、および脂質で形成されるのは、溶液を含有ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)下で、電気泳動によって除去されます。次いで、試料を3散乱光を低減するために一致する屈折率を有する溶液中に浸漬されます。脂質除去システムは、後に高度なCLARITY 13とPACT(パッシブ明確にする技術)10に変更されました。重合後、アクリルアミド鎖はヒドロゲル組織を形成し、タンパク質と架橋します。脂質成分は、アクリルアミドと架橋することはできません。このように、脂質は、SDS含有緩衝液下での電気泳動によって除去することができます。脂質の活性排除を通じて、脳組織は、著しく透明9増加します。しかし、これらの方法は自由拡散によって深い標識の不可能に対処していません。この制限を克服するために、厚い組織の最も深い部分に試薬の能動輸送のための技術が必要とされます。
CLARITYは、組織の清算と深い組織を可能にするが可視化は、それが容易または高速処理ではありません。これは、全体のマウスの脳7,14をクリアするには数週間かかることがあります。組織の急速なクリアはライフサイエンス研究やボリューム診断のための基本的なまたは臨床検査室の設定に、このような方法の適用のために不可欠です。現在のプロトコルは、圧力補助型送達免疫染色によって生体組織クリアランスとそれに続くタンパク質検出のための単純化された方法を提供します。これは、画像化法との組み合わせを介して提出された大規模な3次元データ処理システムの高解像度ボリュームイメージングに適しています。
組織への悪い固定またはヒドロゲルの浸漬は、タンパク質の損失と組織のクリア処理の間に組織の歪みを引き起こす可能性があります。穏やかに振盪しながら18時間 – 全体の成体マウスの脳は12のためのハイドロゲルモノマー溶液の20ミリリットルの最小容積に浸漬し、その後、一晩、4%パラホルムアルデヒド中でインキュベートされるべきです。脳スライスおよび脊髄などのヒト組織を含む大規模な組織では、ヒドロゲルモノマー溶液中で拡張浸漬時間が必要となります。組織固定とポリマー注入ステップが分離されているので、ACTプロトコルは、固定された組織のクリアに容易に適用可能です。組織クリアした後、ヒト組織は、いくつかの抗体でよく染色しました。 ACTクリア技術は、エタノールやメタノールなどのアルコール固定剤、と互換性がないことに注意してください。
組織ヒドロゲル重合工程は、クリア処理以下の良質な組織を生成するために重要です。なぜなら酸素は、アクリルアミドの重合を阻害し、それは、窒素ガス注入システム下組織を含む溶液を脱気することによって除去されるべきです。あるいはまた、脱酸素化は、23時間の加熱ブロックと真空チャンバーを使用して実行することができます。
クリア率は、ほとんどの成体マウスの組織を一晩ETCによってクリアすることができるなどの器官の大きさ、脂質またはECM線維性タンパク質の内容、固定の状態、を含む多数の要因に依存します。しかし、過剰清算および組織腫脹不要の危険性があります。このように、クリア時間の差が重要な考慮事項です。組織クリア条件は、経験的に決定されるべきです。重要なことには、ECMの内容がクリアされた組織の外観に影響を与え得ます。 ACTは、緻密なタンパク質繊維をクリアしていないため、組織の色は、あってもETCバッファ内のACTの後、白または不透明のまま。しかしながら、これらの器官は、RIマッチング溶液中に浸漬したときyが透明になりました。
組織腫脹率は、組織のECMの内容に依存するように表示され、脳などの柔らかい臓器は、高密度の臓器よりも大きな膨潤率を示します。増加した組織の腫れが組織決済手続きを支援するため、ACTは、日常的に、ほとんどの場合、蒸留水ベースのバッファを利用しています。組織の腫脹または過渡変形は、胚のような、望ましくない場合、いくつかのケースでは、緩衝液を含む0.1×PBSは、高分解能イメージングのために適用することができます。また、緩衝液中のより高い塩濃度は、組織の収縮を引き起こす可能性があることに留意すべきです。
ACTの方法は、マウス14の器官全体、さらには全身を明確にすることができます。しかし、透明な組織の深部組織のイメージングは、特殊な顕微鏡や目標が必要です。従って、1〜2mmの厚さの脳組織は、従来の共焦点顕微鏡で画像化するために最も効果的です。私たちの手で、ラベルの除去ACT-処理した組織からのエド抗体は、抗体依存性であり、そして異なる抗体標識のラウンドは推奨されません。このようなTHおよびGFAPなどのいくつかの抗体は、全脳免疫標識14のために特によく働きました。一方、例えばするTuj1またはマップMap2のようないくつかの抗体は、多くの場合、組織の表面のみが標識されます。これは、スイッチ15のような他の方法によって改善されるかもしれません。別の潜在的な制限は、原因で組織クリアステップの間に膨潤・収縮組織のACT加工組織に微細なタンパク質構造を維持することは困難であるかもしれないということです。
PRESTO技術は、組織標識技術の広範囲に適用可能です。例えば、このようなSeeDB 4とiDISCO 7などの前標識された組織を使用して、組織の透明な方法で、緻密な組織の免疫標識は、週に数日より長いインキュベーション期間を必要とします。しかし、さきがけは数時間のインキュベーション時間を短縮することができる、電子1mm厚緻密な組織を持つ日以内に全体のプロセスの完了をnabling。 PRESTOは厚い深い標識、密な組織、あるいは未クリア厚い組織の有効性を高めることができます。 PRESTOテーブルトップ遠心分離機またはシリンジポンプを使用し、特別な装置を必要としないので、ルーチン実験室手順を用いてこの方法を実施することは比較的容易です。
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).
4% Paraformaldehyde | Lugen SCI | LGB-1175-4B | sample fixation |
Acrylamide | Affymetrix | 75820 | Hydrogel monomer solution |
2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries | VA-044 | Hydrogel monomer solution |
Boric acid | Affymetrix | 76324 | ETC buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 18220 | ETC buffer |
Sodium hydroxide pellets | Junsei chemical | 1310-73-2 | ETC buffer |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323A | Immunolabeling |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Immunolabeling |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Immunolabeling |
Collagen type Ⅳ | Abcam | AB6586 | Antibody/immunolabeling |
Tyrosine hydroxylase (TH) | Millipore | AB152 | Antibody/immunolabeling |
Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Life Technologies – Molecular Probes | A21206 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Confocal dish | SPL lifesciences | 101350 | Imaging |
Confocal microscope | Leica | SP8 | Imaging |
Sucrose | Junsei chemical | 31365-0301 | CUBIC-mount solution |
Urea | Affymetrix | 23036 | CUBIC-mount solution |
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma-Aldrich | 122262 | CUBIC-mount solution |
ECT chamber | Logos Biosystems, Inc. | C10101 | ETC system |
ECT chamber controller | Logos Biosystems, Inc. | C10201 | ETC system |
Temperature probe | Logos Biosystems, Inc. | C12101 | ETC system |
Peristatic pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | YZ1515X | ETC system |
Buffer reservoir | Logos Biosystems, Inc. | C10401 | ETC system |
Tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12001 | ETC system |
Container holder for 1 tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12002 | ETC system |
Mouse brain slice holder | Logos Biosystems, Inc. | C12004 | ETC system |
Whole rat brain holder | Logos Biosystems, Inc. | C12007 | ETC system |
Peristaltic pump tubing | Logos Biosystems, Inc. | C12104 | ETC system |
Tabletop-centrifuge | Hanil science industrial Co., Ltd | MICRO 12 | c-PRESTO |
Syringe pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | LSP02-1B | s-PRESTO |
Syringe (20 ml) | Korea vaccine Co., Ltd. | KV-S20 | s-PRESTO |
3-way stopcock | Hyupsung medical Co.,Ltd. | HS-T-01N | s-PRESTO |