ACT-PRESTO: Биологическая ткань Очистка и иммунноокрашивания Методы визуализации Volume

Эксперименты на животных должны соответствовать всем соответствующим государственным и институциональным правилам. 1. Приготовление реагентов Для гидрогель раствора мономера (A4P0): Добавить 20 г акриламида в 450 мл 0.1x фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и регулировать громкость до 500 мл PBS 0.1x. ВНИМАНИЕ: мономеры акриламида являются токсичными. Выполните все процедуры в вытяжном шкафу с средствами индивидуальной защиты, в том числе лица щит, лабораторном пальто, перчатки и закрытую обувь. Непосредственно перед использованием добавляют 100 мг 2,2'-азобис [2- (2-имидазолин-2-ил) пропан] дигидрохлорид к 40 мл раствора мономера гидрогель (A4P0) в 50 мл коническую пробирку под вытяжкой , Для клирингового электрофоретическая ткани (ETC) буфер: Добавьте 40 г додецилсульфата натрия (SDS) и 12,37 г борной кислоты в 800 мл деионизованной H 2 O (дН 2 O). Доводят рН до 8,5 с NaOH и регулировать громкость до1 л с дополнительным дН 2 O. ВНИМАНИЕ: SDS является вредным химическим; Таким образом, обращаться с ним осторожно. Для КУБИЧНОЙ монтажа раствора: Добавить 250 г сахарозы, 125 г мочевины и 125 г N, N, N ', N' -tetrakis (2-гидроксипропил) этилендиамин до 150 мл дН 2 O и довести объем до 500 мл с дН 2 O. 2. Подготовка образцов и фиксация Эвтаназия мыши. Подготовьте alfaxalone (1 мг / кг) и ксилазина (0,5 мг / кг) в одном шприце. Внутрибрюшинно вводят смесь alfaxalone и ксилазином и позволяют 3 мин для мыши, чтобы стать в бессознательном состоянии. Подождите, пока обезболены мыши больше не реагирует на болевые раздражители, такие как хвост крайнем случае, прежде чем продолжить. ВНИМАНИЕ: Следуйте соответствующие институциональные рекомендации по обращению с животными. Транскардиальную обрызгивать мышь со 100 мл 0,9% NaCl (рН 7,4-7,5), растворсодержащие гепарин (100 ед / мл) , чтобы обескровить, с последующим добавлением 100 мл 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS (рН 7,4) 14. ВНИМАНИЕ: Решение PFA является токсичным. Приготовление раствора PFA и всей последующей обработки должны проводиться в вытяжном шкафу и средствами индивидуальной защиты. Отрезать голову мыши, откройте кожу, и сломать череп между глазами, используя маленькие ножницы. Удалить кусочки черепа с помощью маленьких, изогнутых щипцов. Выньте мозг или желаемые органы. Выдержите мозг и органы в пост-FIX 4% раствора PFA при 4 ° С в течение ночи. ПРИМЕЧАНИЕ: Для очистки ткани конкретных-области, рассекают конкретного региона или обрезки ткани после фиксации ткани. ВНИМАНИЕ: Решение PFA является токсичным. Transcardial перфузия и все последующие обращения мыши должны проводиться в вытяжном шкафу и средствами индивидуальной защиты. 3. Гидрогель Мономер Настой и Полymerization Выдержите неподвижные органы в A4P0 растворе гидрогель мономера при температуре 4 ° С в течение 12-24 ч при осторожном встряхивании. Гидрогель мономер-проникнуты полимеризации ткани. Передача образца до 10 мл с круглым дном трубки с 5 мл раствора мономера гидрогель. Заверните верх с круглым дном трубки с парафильмом. Удалить кислород из круглым дном пробирку, содержащую гидрогель проникнуты весь образец мозга мыши при пропускании азота через жидкость в течение 1 мин. Быстро и плотно закрыть образец, содержащий трубку. Перенести трубку к водяной бане (37 & deg; C) в течение 2 ч. Промыть полимеризованный образец кратко с 0.1x PBS для удаления избытка гидрогель. ВНИМАНИЕ: гидрогеля мономеров являются токсичными. Для того, чтобы избежать контакта кожи с гидрогеля мономера, выполнять все процедуры в вытяжном шкафу и средствами индивидуальной защиты, в том числе лица щит, лабораторном пальто и перчатки. Примечание: полимеризованной тканимогут быть сохранены в PBS, содержащем 0,1 x азида натрия в течение более 2-х недель при температуре 4 ° С. ВНИМАНИЕ: азид натрия сильно и остро токсичен. Выполните все процедуры в вытяжном шкафу и средствами индивидуальной защиты, в том числе лица щит, лабораторном пальто и перчатки. 4. Электрофорезная ткани Клиринг (ETC) Передача полимеризованный образца в контейнер ткани и поместите контейнер ткани в ETC камере. Заполните ETC ETC камера с использованием буфера peristatic насоса. Установите условия и т.д., и запустить Т.Д. Используйте следующие параметры. Для настройки и т.д. для целых органов, используйте следующие настройки: (1,5 ампер), температура (37 ° C), время работы (6,0 ч), скорость работы насоса (30 оборотов в минуту). Для настройки и т.д. для толстых срезов мозга мыши от 1 до 2 мм, используйте следующие параметры: ток (1,5 ампер), температура (37 ° C), время работы (2,0 ч), скорость работы насоса (30 оборотов в минуту). Перенос тон очистил образец в коническую пробирку объемом 50 мл с 45 мл PBS 0.1x. Промыть очищенные образцы несколько раз с помощью PBS 0.1x, пока не было пузырей видны, когда трубка на короткое время встряхивают (чтобы подтвердить полное удаление SDS). 5. иммунноокрашивания Закона обработанных тканей Для мыши весь мозг: Инкубируйте образца в объеме 3-мл раствора антитела, содержащего 1X PBS, 6% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,1% Тритон Х-100, и 0,01% азида натрия (антитело раствора разбавления) с разбавлением фактор 1/500 для тирозин гидроксилазы (TH) антитела в течение 4 дней при температуре 37 ° C при умеренном встряхивании. Заменить раствор антитела в конце 2-й день. Отмывки образца в конической трубе 50 мл с 45 мл PBS 0.1x в течение 3 – 5 ч и изменить буфер через каждый час. Инкубируйте образца в объеме 3-мл разведений антител раствора с коэффициентом разбавления 1/500 для осла против кроличьего 488 вторичного антитела в течение 4 дней при температуре 37 ° C при умеренном встряхивании. Replасе разбавленные антитела решения на 2-й день. Для получения 1 до толстой ткани мозга нарезанные 2 мм: Выдержите образец на ночь или на срок до 1 суток в 0,5- до 1-мл объема разбавления раствора антитела с коэффициентом разбавления 1/500 для IV антитела коллагена типа на 37 ° C с мягким встряхиванием. Отмывки образца в конической трубе 15-мл с объемом 12 мл 0.1x PBS в течение 1-2 ч. Изменение буферу каждый час. Инкубируйте образца в 0,5- до 1-мл объеме разведений антител раствора с коэффициентом разбавления 1/500 для Cy-3 конъюгированные анти-кроличий вторичное антитело на ночь или на срок до 1 суток при температуре 37 ° С с мягким встряхиванием. Промыть образец в 0.1x PBS в течение 3 – 5 ч; изменить буферу каждый час. До начала обработки изображений, инкубировать образец в соответствующем количестве кубического монтирования раствора в течение 1 ч при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Заменить свежей кубического крепление раствора и инкубируют в течение еще 1 ч. ЗАМЕТКА: </b> 76 тип антител хорошо работал в мышиных ACT обработанные ткани, в том числе 31 моноклональных антител 14. Предварительно меченных ткани могут быть скомбинированы с иммунноокрашивания еще двух флюорохромами в АКТ-обработанной ткани. 6. иммунноокрашивания плотных тканей (Presto) с-PRESTO Примечание: C-PRESTO подходит для малогабаритных образцов, таких как весь семенника, всей почки или небольших участков крупных органов. Переноса образца в пробирку 1,5 мл, добавляют 500 мкл раствора антитела разбавления коэффициент разбавления 1/500 для коллагена типа IV антитела, и центрифугировать пробирку при 600 х г в течение 2 ч. Промыть окрашенного образца с 0.1x PBS путем центрифугирования при 600 × г в течение 30 мин. Добавьте 500 мкл раствора антитела разбавления коэффициент разбавления 1/500 для Cy-3 конъюгированных с антителом против кроличьего вторичным антителом и центрифуге при 600 × г в течение 2 ч. Вымойте окрашивали образец с 0.1X PBS путем центрифугирования при 600 × г в течение 30 мин. s-PRESTO Примечание: s-PRESTO подходит для больших тканей. Подготовьте шприц (30 мл объема) и подключить его к 3-ходового клапана (рисунок 1А). Клей клапан с клеевой пистолет для условий высокого давления (рис 1В). Передача образца в 3-х ходового клапана подключенного шприца в положении закрытого клапана. Добавьте 5 – 7 мл раствора антител разбавление коэффициент разбавления 1/500 для IV антител коллагена типа. Выпуск раствора антител в образце путем открытия клапана. Установите поршень шприца в положение 17-мл, чтобы обеспечить достаточное пространство для движения инфузии / вывода. Это может быть сделано в положении открытого клапана. Закройте 3-ходовой клапан после того, как установка шприца закончена. Поместите шприц, содержащий образец на шприцевой насос. Установите условия шприцевой насос с объемом инфузии / вывода 10 мл / мин и 4-мин время паузы на режиме непрерывного цикла (рис 1C). ПРИМЕЧАНИЕ: Насос вливает , пока он не достигнет целевого объема (10 мл), а затем направление потока изменяется после короткой паузы (4 мин). Запустить шприцевой насос в течение 3 – 24 ч при комнатной температуре (рис 1F). Откройте 3-ходовой клапан и заменить раствор с 0.1x PBS. Промыть образец окрашивали дважды 0.1x PBS в течение 1 часа каждый раз, используя шприцевой насос. Изменение с разведения антитела раствором, содержащим Cy-3 сопряженную анти-кроличьего вторичное антитело (разведение фактор 1/500) и запустить шприцевой насос в течение 3 – 24 ч. Откройте 3-ходовой клапан и заменить раствор с 0.1x PBS. До начала обработки изображений, инкубировать образец окрашивали в соответствующем количестве кубического-крепление раствора в течение 1 ч при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Заменить свежей кубического крепление раствора и инкубируют в течение еще 1 ч. 7. Яmaging Поместите помеченную ткани в конфокальной блюдо и добавить кубического монтирования решение, пока ткань не покроется. Поместите покровное на ткани. С помощью конфокальной микроскопии для получения изображения ткани 14 под цели 10X.