ACT-PRESTO: Biyolojik Doku Takas ve Hacim Görüntüleme için ile immün Yöntemleri

Hayvan deneyleri ilgili tüm devlet ve kurumsal düzenlemelere uygun olmalıdır. Reaktiflerin 1. Hazırlık Hidrojel monomer çözeltisi (A4P0) için: 0.1X fosfat tamponlu tuz 450 mL (PBS) akrilamid 20 gr ekleyin ve 0.1x PBS ile 500 mL göre ayarlayın. DİKKAT: akrilamid monomerleri toksiktir. Bir yüz maskesi, bir laboratuvar ceket, eldiven ve kapalı parmak ayakkabılar dahil, kişisel koruyucu ekipman ile davlumbaz tüm prosedürleri uygulayın. Kullanmak davlumbaz altında 50 ml konik bir tüp içinde 2,2'-azobis [2- (2-imidazolin-2-il) propan] hidrojel monomer çözeltisi 40 mL (A4P0) dihidroklorür, 100 mg eklemek için hemen önce . Elektroforetik doku temizleme (VB) tampon için: sodyum dodesil sülfat (SDS) ve deiyonize H2O (DH 2 O) 800 mL borik asit 12.37 g, 40 g ekleyin. NaOH ile 8.5 pH ayarlayın ve ses seviyesini ayarlamakEk DH 2 O. ile 1 L DİKKAT: SDS bir zararlı kimyasal olduğu; Bu nedenle, dikkatli bir şekilde taşıyın. Kübik bağlama çözeltisi için: sükroz 250 g üre 125 g ve N, N, N, 125 g dH 2 O 150 mL ', N' -tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiamin ekleyin ve hacmi getirmek dH 2 O 500 mL 2. Numune Hazırlama ve Fixation fare Ötenazi. Aynı şırıngada alfaksalondur (1 mg / kg) ve ksilazin (0.5 mg / kg) hazırlayın. Intraperitoneal alfaksalondur ve ksilizin karışımı enjekte ve fare için 3 dakika baygın hale gelmesini sağlar. anestezi fare artık devam etmeden önce, böyle bir kuyruk tutam gibi ağrılı uyaranlara, yanıt verene kadar bekleyin. DİKKAT: hayvanları işlenmesi için uygun kurumsal yönergeleri izleyin. Transcardially 100 mL% 0.9 NaCl (pH 7.4-7.5) çözümü ile fare serpmek1x PBS içinde% 4 paraformaldehid, 100 mL (PFA) (pH 7.4), 14, ardından (100 U / ml) asıl bulbus olfaktoryusları alındı için heparin ihtiva ederler. DİKKAT: PFA çözüm toksiktir. PFA çözüm ve sonraki tüm kullanım hazırlanması davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipman ile yapılmalıdır. Fare kafasını kesti cilt kadar açık ve küçük makas kullanarak gözler arasındaki kafatası kırmak. küçük, kavisli forseps kullanarak kafatası parçalarını çıkartın. beyin veya istenilen organları dışarı atın. gece boyunca 4 ° C'de post-düzeltme% 4 PFA çözeltisi içinde beyin ve organlar inkübe edin. NOT: Belirli bölge doku temizleme için, belirli bir bölgeyi incelemek veya doku tespit sonrasında doku kırpın. DİKKAT: PFA çözüm toksiktir. transcardial perfüzyon ve sonraki tüm fare kontrolü davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipman ile yapılmalıdır. 3. Hidrojel Monomer İnfüzyon ve Polymerization hafifçe çalkalanarak, 12-24 saat boyunca 4 ° C 'de A4P0 hidrojel monomer çözeltisi içinde fikse edilmiş organlar inkübe edin. Hidrojel doku polimerizasyonu monomer aşılamıştır. Hidrojel monomer çözeltisi 5 mL, 10 ml lik yuvarlak dipli tüp örnek aktarın. Parafilm ile yuvarlak alt tüp üst sarın. 1 dakika boyunca sıvı içinden nitrojen kabarcıklanarak hidrojel infüzyon bütün fare beyin örneği içeren yuvarlak dipli tüp oksijeni uzaklaştırmak. Hızlı ve sıkıca örnek içeren tüp kapatın. 2 saat süre ile bir su banyosunda (37 ° C), tüp aktarın. Fazla hidrojel çıkarmak için 0.1x PBS ile kısaca polimerize örnek yıkayın. DİKKAT: Hidrojel monomerler zehirlidir. Hidrojel monomer ile cilt temasından kaçınmak davlumbaz ve bir yüz maskesi, bir laboratuvar ceket ve eldiven gibi kişisel koruyucu ekipman ile tüm işlemleri gerçekleştirmek için. NOT: polimerize dokular4 ° C de en az 2 hafta boyunca 0,1 x PBS içeren sodyum azid saklanabilir. DİKKAT: Sodyum azit yüksek ve akut toksik değildir. Bir yüz maskesi, bir laboratuvar ceket ve eldiven gibi, davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipman ile tüm prosedürleri uygulayın. 4. Elektroforetik Doku Takas (ETC) Bir doku kaba polimerize örnek aktarın ve ETC odasında doku kap yerleştirin. peristatic pompası kullanılarak kullanıcıya tampon ile VB bölmesini doldurmak. ETC koşullarını ayarlamak ve VS. çalıştırın Aşağıdaki ayarları kullanın. zaman (6.0 saat), pompa hızını (30 rpm) çalıştıran, (1.5 amp), sıcaklık (37 ° C): Bütün organlar için ETC ayarları için, aşağıdaki ayarları kullanın. zaman (2.0 saat), pompa hızını (30 rpm) çalışan akımı (1.5 amp), sıcaklık (37 ° C): 1- 2 mm kalınlığında fare beyin dilimleri için ETC ayarları için, aşağıdaki ayarları kullanın. aktarım tO 0.1x PBS 45 mL bir 50 mL konik tüp örnek temizlenir. Tüp kısaca sarsıldığında hiçbir kabarcıklar görülür kadar 0.1x PBS ile temizlenir örnek birkaç kez yıkayın (SDS tamamen kaldırılmasını onaylamak için). ACT işlenmiş Dokuların 5. ile immün Fare tüm beyin için: 1 x PBS,% 6 sığır serum albümini (BSA) ihtiva eden bir antikor çözeltisi 3 ml hacminde örnek inkübe% 0.1 Triton X-100 ve% 0.01 sodyum azid (antikor seyreltme çözeltisi) seyreltme hafif çalkalama ile 37 ° C'de 4 gün boyunca tirosin hidroksilaz (TH) antikor 1/500 faktörü. 2. günde sonunda antikor çözüm değiştirin. 3 45 mL 0.1x PBS ile bir 50 mL konik tüp içinde örnek yıkayın – 5 saat ve tampon her saat değiştirin. Hafif çalkalama ile 37 ° C'de 4 gün boyunca eşek anti-tavşan sekonder antikor 488 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi 3 ml hacminde örnek inkübe edin. repl2 gün seyreltilmiş antikor çözümler ace. 2 mm kalınlığında dilimlenmiş beyin dokusu: 1-: gece boyunca ya da 1 gün için 37 ° kollajen tip IV antikor 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi bir 0.5- 1 ml hacim olarak örnek inkübe hafif sallayarak ° C. 1-2 saat boyunca 0,1 x PBS, 12 ml hacme sahip 15 ml konik bir tüp içinde örnek yıkayın. bir tampon her saat değiştirin. anti-tavşan sekonder antikor gece boyunca ya da hafif çalkalanarak 37 ° C'de en fazla 1 gün için Cy3-konjüge edilmiş 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi bir 0.5- 1 mL hacminde örnek inkübe edin. 3 0.1x PBS örnek yıkayın – 5 saat; bir tampon her saat değiştirin. görüntüleme öncesi, hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında 1 st için kübik bağlama çözeltisi, uygun bir miktarda örnek inkübe edin. Taze kübik bağlama çözeltisi ile değiştirin ve ilave bir 1 saat daha inkübe edilir. NOT: </b> Antikorların 76 tipi 31 monoklonal antikorlar 14 de dahil olmak üzere, fare ACT işlenmiş dokuda iyi çalıştı. Önceden etiketlenmiş doku ACT işlenmiş doku iki florokromların immunolabeling ile birleştirilebilir. Yoğun Dokuların 6. ile immün (PRESTO) Cı-PRESTO Not: C-SAYGINLIK gibi tüm testis, tüm böbrek ya da daha büyük bir organ küçük bölümler gibi küçük boyutlu örnekleri, için uygundur. Bir 1.5 ml tüp içine örnek aktarın kollajen tip IV antikor 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi 500 ul ekle ve 2 saat boyunca 600 x g'de santrifüj tüpü. 30 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleme ile 0.1x PBS ile lekelenmiş numunenin yıkayın. 2 saat süre ile 600 x g 'de Cy3-konjüge edilmiş anti-tavşan sekonder antikor ve santrifüj için 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi 500 ul ekle. 0 ile boyandı örnek yıkayın.30 dakika süre ile 600 x g 'de santrifüj ile 1x PBS ile yıkandı. s-PRESTO Not: S-PRESTO büyük dokular için uygundur. Bir şırınga (30 ml hacim) hazırlayın ve 3 yollu vana (Şekil 1A) bağlayın. Yüksek basınç şartları (Şekil 1B) için bir tutkal tabancası ile vana Tutkal. kapalı valf pozisyonunda 3-yollu vana bağlantılı şırınganın içine örnek aktarmak. kolajen tip IV antikor 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi 7 mL – 5 ekleyin. vanasını açarak numune içine antikor çözüm bırakın. infüzyon / çekme hareketi için yeterli oda sağlamak için 17-ml pozisyonuna şırınga pistonu ayarlayın. Bu açık valf pozisyonunda yapılabilir. şırınga ayarı bittikten sonra 3 yollu vanasını kapatın. Bir şırınga pompası örneğini içeren şırınga koyun. 10 mL / dak enfüzyon / çekme hacmi ve 4- şırıngayla koşulları ayarlamadk sürekli döngü modunda (Şekil 1C) üzerindeki duraklama süresi. NOT: Bu hedef hacmi (10 ml) ve daha sonra kısa bir duraklama (4 dk) sonra akış değişiklikleri yönünü ulaşıncaya kadar pompa aşılamaktadır. Oda sıcaklığında (Şekil 1F) 24 saat – 3 için enjektör pompasını çalıştırır. 3-yollu vanasını açın ve 0.1x PBS ile çözüm değiştirin. şırınga pompası kullanılarak 1 saat boyunca 0,1 x PBS ile iki kez, her zaman lekeli örnek yıkayın. Cy3-konjüge edilmiş anti-tavşan ikincil antikoru (1/500 seyreltme faktörü) ihtiva eden antikor seyreltme çözeltisi ile değiştirin ve 3 şırınga pompası çalıştırılır – 24 saat. 3-yollu vanasını açın ve 0.1x PBS ile çözüm değiştirin. görüntüleme öncesi, hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında 1 st için kübik bağlama çözeltisi, uygun bir miktarda lekeli örnek inkübe edin. Taze kübik bağlama çözeltisi ile değiştirin ve ilave bir 1 saat daha inkübe edilir. 7. Benmaging Konfokal tabağına etiketli doku yerleştirin ve doku kaplıdır kadar CUBIC montaj çözüm ekleyin. doku üzerinde bir lamel yerleştirin. 10X objektif altında görüntüye doku 14 konfokal mikroskop kullanın.