ACT-المعزوفة: المقاصة الأنسجة البيولوجية وطرق Immunolabeling للتصوير حجم
Summary
ACT-المعزوفة (نشط الوضوح تقنية ضغط المتعلقة نقل فعال ومستقر من الجزيئات في الأجهزة) يمكن إزالة الأنسجة سريعة وفعالة وغير مكلفة ولكن واختراق الأجسام المضادة السريع إلى أنسجة مسح عن طريق الانتشار السلبي أو تسليم بمساعدة الضغط. باستخدام هذه الطريقة، مجموعة واسعة من الأنسجة يمكن إزالتها، immunolabeled بواسطة الأجسام المضادة متعددة، والحجم تصوير.
Abstract
تحديد واستكشاف المنظمة مفصلة من الأجهزة أو الجسم كله على المستوى الخلوي تحديات أساسية في البيولوجيا. تتطلب أساليب الانتقالية قدرا كبيرا من الوقت والجهد للحصول على صورة 3D وبما في ذلك باجتزاء الأنسجة سليمة، immunolabeling، والتصوير الأنسجة مقطوع متسلسل، الذي ينتج فقدان المعلومات في كل خطوة من هذه العملية. في المناهج المطورة حديثا عالية الدقة التصوير داخل الأنسجة سليمة، وقيدت التوصيف الجزيئي لوضع العلامات على البروتينات. ومع ذلك، بروتوكولات المتاحة حاليا لتطهير الجهاز تتطلب الوقت عملية طويلة إلى حد كبير، مما يجعل من الصعب تنفيذ تقنيات إزالة الأنسجة في المختبر. أنشأنا مؤخرا يسمى بروتوكول السريع ودرجة عالية من استنساخه ACT-المعزوفة (أ التفاعلية الذي نظمه ج larity ر echnique- ص ص ressure مبتهج ه fficient والصورة الجدول ر ransferمن الجزيئات إلى س rgans)، والذي يسمح لإزالة الأنسجة في غضون عدة ساعات. وعلاوة على ذلك، ACT-المعزوفة تمكن immunolabeling السريع مع الأساليب التقليدية ويسرع اختراق الأجسام المضادة في طبقة عميقة من تشكيل كثيفة، عينات سميكة من خلال تطبيق تدفق الضغط أو الحمل الحراري. نحن تصف كيفية إعداد الأنسجة، وكيفية مسح عن طريق إزالة الدهون باستخدام الكهربائي، وكيفية المناعية وصمة عار عن طريق تسليم بمساعدة الضغط. وسرعة وثبات بروتوكول الإسراع في أداء 3D البحوث النسيجي والتشخيص القائم على وحدة التخزين.
Introduction
واحدة من التحديات في علم الأعصاب هو التصور من دائرة الأسلاك العصبية والخلايا الفردية داخل أنسجة الدماغ سليمة. حتى وقت قريب، مما يدل على وصلات بين الخلايا العصبية في هذه الطريقة المطلوبة 1) باجتزاء المسلسل من الأنسجة. 2) وضع العلامات الجزيئية أهداف محددة، مثل محاور عصبية أو البروتينات. و3) التصور من إعادة الإعمار 3D من الدماغ كله عبر التخليص الحسابية أو محاذاة 2D الصور المتسلسلة 1. هذه الخطوات هي شاقة، تتطلب قدرا كبيرا من الوقت، وعرضة لفقدان المعلومات أثناء باجتزاء ووضع العلامات، مما يجعل رسم الخرائط شبكة الخلايا العصبية صعبة للغاية. ومع ذلك، فقد تم تطوير العديد من الطرق التي تسمح لتصور من أنسجة سليمة دون باجتزاء. الأنسجة البيولوجية يمكن أن تكون شفافة بصريا من خلال تقنيات النسيج إزالة 2-10. واحدة من الطرق الرئيسية هي للحد من الخلافات معامل الانكسار بين أنسجة سليمة والحل الغمر من أجلللحد من تشتت الضوء في أنسجة سليمة، مما يجعل الأنسجة شفافة وتمكين مراقبة البنى العميقة. بعض أنواع من الحلول الغمر لها خصائص مسعور، مما يؤدي إلى تبريد الفلورسنت سريع أثناء إجراء الجفاف. لذلك، هذه الأساليب غير متوافقة مع التصوير الفلورسنت على مدى فترة طويلة من الزمن 11،12. بدلا من الكواشف مسعور، وأساليب أخرى تستخدم الكواشف ماء للمقاصة الأنسجة، مثل SeeDB 4 وهيئة السلع التموينية ل ه 6، التي تحافظ على المعلومات الهيكلية ومضان من 4،6،8 الأنسجة البيولوجية. ومع ذلك، الجزيئات، بما في ذلك الأجسام المضادة، لا يمكن أن تصل إلى جوهر أنسجة سليمة عن طريق الانتشار وحدها. ولذلك، فإن ما قبل وضع العلامات من الجزيئات المستهدفة في المناطق العميقة من الأنسجة المزدحمة بالسكان، يمثل تحديا تقنيا.
في البلدان المتقدمة مؤخرا طريقة الأنسجة المقاصة وضوح 3، ط الأنسجة البيولوجية جزءا لا يتجزأ من هيدروجيلق شكلت مع مادة الأكريلاميد، وتتم إزالة الدهون من قبل الكهربائي تحت دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) حل المحتوية. ثم تغمر العينة في محلول مع مؤشر يعكس مطابقة للحد من تشتت الضوء 3. تم تعديل نظام إزالة الدهون في وقت لاحق في وضوح متقدمة 13 و باكت (تقنية الوضوح المنفعلة) 10. بعد البلمرة، وسلاسل الأكريلاميد تشعبي مع البروتينات، وتشكيل هيدروجيل الأنسجة. مكونات الدهون لا يمكن تشعبي مع مادة الأكريلاميد. وبالتالي، والدهون يمكن القضاء عليها من قبل الكهربائي تحت المخزن المؤقت SDS التي تحتوي على. من خلال القضاء الفعال من الدهون، وأنسجة المخ يزيد بشكل واضح في الشفافية 9. ومع ذلك، هذه الأساليب لا تعالج استحالة العميق وضع العلامات عن طريق الانتشار مجانا. للتغلب على هذا القيد، يطلب من تقنيات لنقل نشط من الكواشف في الأجزاء الأعمق من الأنسجة السميكة.
على الرغم من وضوح يسمح المقاصة الأنسجة والأنسجة العميقةالتصور، فإنه ليس إجراء سهلة أو سريعة. يمكن أن يستغرق عدة أسابيع لمسح كامل 7،14 مخ الفأر. المقاصة السريع للأنسجة أمر ضروري لتطبيق مثل هذه الأساليب لضبط المختبرية الأساسية أو السريرية لبحوث علوم الحياة أو تشخيص حجم. وينص البروتوكول الحالي عملية مبسطة لإزالة الأنسجة البيولوجية وكشف عن البروتين لاحق من قبل بمساعدة ضغط التسليم المناعية تلطيخ. انها مناسبة لعالية الدقة حجم التصوير من أنظمة معالجة البيانات الكبيرة المقدمة و 3D من خلال الجمع مع أساليب التصوير.
Protocol
Representative Results
Discussion
الفقراء تثبيت أو الغمر هيدروجيل إلى الأنسجة يمكن أن يسبب فقدان البروتينات وتشويه الأنسجة أثناء عملية تطهير الأنسجة. يجب حضنت الكبار كله مخ الفأر في 4٪ بارافورمالدهيد بين عشية وضحاها، تليها الانغماس في حد أدنى لحجم 20 مل من هيدروجيل حل مونومر ل12-18 ساعة مع الهز لطيف. لأنسجة كبيرة، بما في ذلك الأنسجة البشرية مثل شرائح الدماغ والحبل الشوكي، وسعت تمرغ الوقت في حل هيدروجيل مونومر هو مطلوب. بروتوكول ACT ينطبق بسهولة إلى إزالة الأنسجة الثابتة ليتم فصل خطوات تثبيت الأنسجة وحقن البوليمر. بعد تطهير الأنسجة، والأنسجة البشرية الملون بشكل جيد مع العديد من الأجسام المضادة. لاحظ أن هذه التقنية ACT المقاصة ليست متوافقة مع مثبتات الكحول، مثل الإيثانول والميثانول.
الخطوة البلمرة الأنسجة هيدروجيل أمر بالغ الأهمية لإنتاج أنسجة نوعية جيدة بعد عملية المقاصة أيضا. لانالأكسجين يمنع البلمرة الأكريلاميد، يجب إزالته بواسطة التفريغ الحل التي تحتوي على الأنسجة تحت نظام النيتروجين ضخ الغاز. بدلا من ذلك، إزالة الأوكسجين التي يمكن تشغيلها باستخدام فراغ الغرفة مع كتلة الحرارة لمدة 23 ساعة.
معدل المقاصة يعتمد على عوامل عديدة، بما في ذلك حجم الجهاز، ومحتويات الدهون أو ECM البروتينات الليفية، وحالة من التثبيت، وما إلى ذلك معظم الأنسجة الماوس الكبار يمكن إزالتها عن طريق ETC بين عشية وضحاها. ومع ذلك، هناك خطر لا لزوم لها على مدى المقاصة وتورم الأنسجة. وبالتالي، فإن الاختلافات في وقت المقاصة هي من الاعتبارات المهمة. يجب أن تحدد شروط الأنسجة إزالة تجريبيا. الأهم من ذلك، محتويات ECM قد تؤثر على ظهور أنسجة مسح. لون الأنسجة يبقى أبيض أو مبهمة، وحتى بعد ACT في المخزن ETC، لأن القانون لا مسح ألياف البروتين الكثيفة. ومع ذلك، عندما كانت مغمورة هذه الأجهزة في ري حل مطابقة، وأصبح ذ شفافة.
ويبدو أن معدل تورم الأنسجة أن تعتمد على محتويات ECM من الأنسجة، والأجهزة لينة، مثل الدماغ، يحمل نسبة التورم أكبر من أجهزة الكثيفة. لأن زيادة الأنسجة تورم سيساعد هذا الإجراء الأنسجة المقاصة، ACT بشكل روتيني يستخدم المقطر عازلة المياه القائمة في معظم الحالات. في بعض الحالات، عندما تورم الأنسجة أو تشوه عابرة غير مرغوب فيه، كما هو الحال في الأجنة، ويمكن تطبيقها العازلة التي تحتوي على 0.1X برنامج تلفزيوني عالية الدقة التصوير. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن تركيز الملح أعلى في المخزن المؤقت قد يتسبب في انكماش الأنسجة.
طريقة ACT يمكن توضيح الأجهزة كلها، وحتى الجسم كله على فأرة الحاسوب 14. ومع ذلك، والتصوير الأنسجة العميق من نسيج شفاف يتطلب المجاهر وأهداف خاصة. وهكذا، أنسجة المخ 1- إلى 2 مم هو الأكثر فعالية للتصوير مع المجهر متحد البؤر التقليدية. في أيدينا، وإزالة الملصقالأجسام المضادة إد من الأنسجة المصنعة ACT هي التي تعتمد على الأجسام المضادة، ولا ينصح جولات من مختلف العلامات الأجسام المضادة. عدة الأجسام المضادة، مثل TH وGFAP، عملت بشكل جيد وخاصة لكامل الدماغ immunolabeling 14. من ناحية أخرى، فإن بعض الأجسام المضادة، مثل Tuj1 أو MAP2، وغالبا ما وصفت فقط من سطح الأنسجة. يمكن تحسين ذلك عن طريق وسائل أخرى، مثل سويتش 15. الحد محتمل آخر هو أنه قد يكون من الصعب الحفاظ على الهياكل بروتين الجميلة في الأنسجة المصنعة ACT بسبب تورم الأنسجة وانكماش خلال خطوة إزالة الأنسجة.
تقنية المعزوفة هي التي تنطبق على مجموعة واسعة من تقنيات النسيج وضع العلامات. على سبيل المثال، في وسائل الأنسجة شفافة باستخدام الأنسجة وصفت مسبقا، مثل SeeDB 4 و 7 iDISCO، immunolabeling من الأنسجة الكثيفة يتطلب فترات حضانة أطول من عدة أيام إلى أسابيع. ومع ذلك، يمكن المعزوفة تقصير فترة حضانة لعدة ساعات، والبريدnabling الانتهاء من العملية برمتها في غضون يوم مع 1 ملم الأنسجة الكثيفة سميكة. المعزوفة يمكن أن تعزز فعالية العميق وضع العلامات سميكة، والأنسجة الكثيفة، أو الأنسجة السميكة حتى الامم المتحدة تطهيرها. لأن المعزوفة يستخدم جهاز للطرد المركزي فوق المنضدة أو ضخ حقنة و لا يتطلب أي معدات خاصة، فمن السهل نسبيا لتنفيذ هذه التقنية مع الإجراءات المخبرية الروتينية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Lugen SCI | LGB-1175-4B | sample fixation |
| Acrylamide | Affymetrix | 75820 | Hydrogel monomer solution |
| 2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries | VA-044 | Hydrogel monomer solution |
| Boric acid | Affymetrix | 76324 | ETC buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 18220 | ETC buffer |
| Sodium hydroxide pellets | Junsei chemical | 1310-73-2 | ETC buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323A | Immunolabeling |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Immunolabeling |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Immunolabeling |
| Collagen type Ⅳ | Abcam | AB6586 | Antibody/immunolabeling |
| Tyrosine hydroxylase (TH) | Millipore | AB152 | Antibody/immunolabeling |
| Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Secondary antibody/ immunolabeling |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Life Technologies – Molecular Probes | A21206 | Secondary antibody/ immunolabeling |
| Confocal dish | SPL lifesciences | 101350 | Imaging |
| Confocal microscope | Leica | SP8 | Imaging |
| Sucrose | Junsei chemical | 31365-0301 | CUBIC-mount solution |
| Urea | Affymetrix | 23036 | CUBIC-mount solution |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma-Aldrich | 122262 | CUBIC-mount solution |
| ECT chamber | Logos Biosystems, Inc. | C10101 | ETC system |
| ECT chamber controller | Logos Biosystems, Inc. | C10201 | ETC system |
| Temperature probe | Logos Biosystems, Inc. | C12101 | ETC system |
| Peristatic pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | YZ1515X | ETC system |
| Buffer reservoir | Logos Biosystems, Inc. | C10401 | ETC system |
| Tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12001 | ETC system |
| Container holder for 1 tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12002 | ETC system |
| Mouse brain slice holder | Logos Biosystems, Inc. | C12004 | ETC system |
| Whole rat brain holder | Logos Biosystems, Inc. | C12007 | ETC system |
| Peristaltic pump tubing | Logos Biosystems, Inc. | C12104 | ETC system |
| Tabletop-centrifuge | Hanil science industrial Co., Ltd | MICRO 12 | c-PRESTO |
| Syringe pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | LSP02-1B | s-PRESTO |
| Syringe (20 ml) | Korea vaccine Co., Ltd. | KV-S20 | s-PRESTO |
| 3-way stopcock | Hyupsung medical Co.,Ltd. | HS-T-01N | s-PRESTO |
References
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Dodt, H. -. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. NATURE. 497, 332-337 (2013).
- Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Kim, S. -. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends Cogn Sci. 17, 596-599 (2013).
- Yushchenko, D. A., Schultz, C. Tissue clearing for optical anatomy. Angew Chem Int Edit. 52, 10949-10951 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631 (2016).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163, 1500-1514 (2015).
