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Biology

ACT-PRESTO: Clearing tecido biológico e Métodos imunomarcação for Imaging Volume

Published: December 31, 2016
doi:
10.3791/54904
,
1Department of Anatomy,Korea University College of Medicine

Summary

ACT-PRESTO (clareza técnica de pressão ativo relacionado transferência eficiente e estável de macromoléculas em órgãos) permite o rápido e eficiente, mas barato compensação tecido e penetração anticorpo rápida nos tecidos foi afastada pelo difusão passiva ou parto assistido à pressão. Usando este método, uma vasta gama de tecidos pode ser apagada, por immunolabeled anticorpos múltiplos, e o volume-fotografada.

Abstract

A identificação e exploração da organização detalhada de órgãos ou de todo o corpo no nível celular são desafios fundamentais da biologia. métodos de transição requerem uma quantidade substancial de tempo e esforço para obter uma imagem 3D e incluindo o seccionamento do tecido intacto, imunomarcação e imagiologia do tecido em série em corte, o que produz uma perda de informação em cada passo do processo. Em abordagens recentemente desenvolvidas para imagens de alta resolução dentro do tecido intacto, caracterização molecular foi restringido à rotulagem de proteínas. No entanto, os protocolos disponíveis atualmente para compensação de órgãos exigem um tempo de processo consideravelmente longo, tornando-se difícil de implementar técnicas de limpeza de tecidos em laboratório. Recentemente, estabeleceu um protocolo rápido e altamente reprodutível denominado ACT-PRESTO (a ctive c laridade t echnique- p ressão r exultante e ficiente e s tabela t ransferênciade macromoléculas para o rgans), o que permite o afastamento do tecido dentro de várias horas. Além disso, ACT-PRESTO permite imunomarcação rápida com os métodos convencionais e acelera a penetração de anticorpos na camada profunda da densamente formados espécimes, de espessura através da aplicação de fluxo de pressão ou convecção. Nós descrevem como preparar tecidos, como limpar pela remoção de lipídios usando eletroforese, e como imuno-mancha por um parto assistido à pressão. A rapidez e consistência do protocolo irá acelerar o desempenho da investigação histológica 3D e diagnósticos baseados no volume.

Introduction

Um dos desafios da neurociência é a visualização de fiação do circuito neuronal e as células individuais dentro do tecido cerebral intacto. Até recentemente, demonstrando as conexões entre os neurônios desta forma necessária 1) cortes seriados de tecidos; 2) rotulagem molecular de alvos específicos, como axônios ou proteínas; e 3) a visualização de reconstrução 3D de todo o cérebro através de registro computacional ou o alinhamento das imagens em série 2D 1. Estes passos são trabalhoso, requer uma grande quantidade de tempo, e são susceptíveis de perder informações durante o corte e rotulagem, fazendo o mapeamento de rede neuronal extremamente difícil. No entanto, muitos métodos que permitem a visualização de tecido intacto, sem corte têm sido desenvolvidos. Os tecidos biológicos pode ser feita opticamente transparente por meio de técnicas de limpeza de tecido 2-10. Um dos principais métodos é reduzir as diferenças do índice de refracção entre o tecido intacto e a solução de imersão em ordempara reduzir a dispersão da luz no tecido intacto, tornando assim o tecido transparente e permitindo a observação de estruturas profundas. Alguns tipos de soluções de imersão tem propriedades hidrofóbicas, o que resulta na rápida paragem da fluorescência durante o processo de desidratação. Por conseguinte, estes métodos não são compatíveis com imagens fluorescentes ao longo de um longo período de tempo de 11,12. Em vez de reagentes hidrofóbicas, outros métodos utilizam reagentes hidrofílicos para limpeza de tecidos, tais como SeeDB 4 e Sca l e 6, que mantêm a informação estrutural e de fluorescência do 4,6,8 tecido biológico. Contudo, macromoléculas, incluindo anticorpos, podem não alcançar o núcleo de tecido intacto por difusão por si só. Portanto, a pré-marcação de moléculas alvo em áreas profundas de tecidos densamente-embalados é tecnicamente desafiador.

Num método tecido desobstrução-recentemente desenvolvidos, Clareza 3, um i de tecido biológico embebido em hidrogels formados com acrilamida, e os lípidos são removidos por electroforese sob sulfato de dodecilo de sódio (SDS) a solução molecular contendo. A amostra é então imerso numa solução com um índice de reflexão correspondente para reduzir a luz de espalhamento 3. O sistema de remoção de lípidos foi posteriormente modificada em clareza avançada 13 e PACT (técnica de clareza passiva) 10. Após a polimerização, as cadeias de ligação cruzada com proteínas de acrilamida, formando hidrogel-tecido. componentes lipídicos pode não reticulam com acrilamida; Assim, os lípidos podem ser eliminados por electroforese sob o tampão contendo SDS. Através da eliminação ativa de lipídios, o tecido cerebral aumenta acentuadamente em transparência 9. No entanto, estes métodos não abordam a impossibilidade de deep-rotulagem por difusão livre. Para superar essa limitação, técnicas para o transporte ativo de reagentes para as partes mais profundas de tecidos grossos são necessários.

Embora CLAREZA permite compensação de tecido e tecido-fundovisualização, não é um processo fácil ou rápido. Ele pode levar várias semanas para limpar a 7,14 cérebro do rato inteiro. compensação rápida dos tecidos é essencial para a aplicação de tais métodos para definições básicas ou clínicas laboratoriais para pesquisa de ciências biológicas ou diagnóstico volume. O protocolo atual fornece um processo simplificado para apuramento tecido biológico e detecção da proteína subsequente mediante a entrega de imuno-coloração assistida por pressão. É apropriado para a formação de imagens espaciais de alta resolução de sistemas de processamento de dados arquivados grandes e 3D através da combinação com métodos de imagem.

Protocol

experiências em animais devem estar em conformidade com todas as normas governamentais e institucionais relevantes. 1. Preparação dos Reagentes Para a solução de hidrogel monómero (A4P0): Adiciona-se 20 g de acrilamida e 450 mL de 0,1 x solução salina tamponada com fosfato (PBS) e ajustar o volume a 500 ml com 0,1 x PBS. CUIDADO: monómeros acrilamida são tóxicos. Efectuar todos os procedimentos em um exaustor com equipamento de protecção pessoal, incluindo um escudo de rosto, uma bata de laboratório, luvas e sapatos fechados. Imediatamente antes de usar, adicionar 100 mg de 2,2'-azobis [2- (2-imidazolin-2-il) propano] di-hidrocloreto a 40 mL de solução de monómero de hidrogel (A4P0) num tubo cónico de 50 mL sob uma coifa . Para a limpeza de tecidos electroforética (ETC) tampão: Adicionar 40 g de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) e 12,37 g de ácido bórico e 800 mL de H 2 O desionizada (dH2O). Ajustar o pH para 8,5 com NaOH e ajustar o volume para1 L com DH adicional de 2 O. CUIDADO: SDS é um produto químico prejudicial; portanto, lidar com isso com cuidado. Para a solução CUBIC de montagem: Adicionar 250 g de sacarose, 125 g de ureia e 125 g de N, N, N ', N' -tetraquis (2-hidroxipropil) etilenodiamina e 150 ml de dH 2 O e perfazer o volume para 500 mL com dH2O 2. Preparação de amostras e Fixação Eutanásia do mouse. Prepara-se o alfaxalona (1 mg / kg) e xilazina (0,5 mg / kg) na mesma seringa. Intraperitoneal injetar a mistura de alfaxalona e xilazina e permitir que 3 min para o mouse para se tornar inconsciente. Espere até que o rato anestesiado já não responde a estímulos dolorosos, como uma pitada cauda, ​​antes de prosseguir. ATENÇÃO: Siga as orientações institucionais apropriados para a manipulação de animais. Transcardialmente perfundir o rato com 100 mL de NaCl a 0,9% (pH 7,4-7,5) solução decontendo heparina (100 U / mL) para desangrar, seguido por 100 mL de 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS 1x (pH 7,4) 14. CUIDADO: solução PFA é tóxico. A preparação da solução de PFA e todo o tratamento posterior deve ser conduzida em um exaustor e com equipamento de protecção individual. Cortar a cabeça do rato, abrir a pele, e quebrar o crânio entre os olhos usando uma tesoura pequena. Remover pedaços do crânio usando pequenas pinças, curvado. Retire do cérebro ou órgãos desejados. Incubar o cérebro e os órgãos em pós-fix solução PFA a 4% a 4 ° C durante a noite. NOTA: Para específica da região de compensação de tecidos, dissecar a região específica ou cortar o tecido após a fixação do tecido. CUIDADO: solução PFA é tóxico. A perfusão transcardial e todo o tratamento posterior do rato deve ser conduzida em um exaustor e com equipamento de protecção individual. 3. Hidrogel Monómero de infusão e Polymerization Incubar os órgãos fixos em solução hidrogel monómero A4P0 a 4 ° C durante 12-24 horas com agitação suave. Hidrogel monómero-infundido polimerização tecido. Transfira a amostra para um tubo de fundo redondo de 10 mL com 5 mL de solução de monómero de hidrogel. Enrole a parte superior do tubo de fundo redondo com Parafilm. Remover o oxigénio a partir do tubo de fundo redondo contendo o rato inteiro amostra infundidos cérebro-hidrogel fazendo borbulhar azoto através do líquido durante 1 minuto. De forma rápida e firmemente fechar o tubo contendo amostra. Transferir o tubo para um banho-maria (37 ° C) durante 2 h. Lava-se a amostra polimerizada brevemente com 0,1 x PBS para remover o excesso de hidrogel. CUIDADO: monómeros de hidrogel são tóxicos. Para evitar o contato da pele com monômero de hidrogel, execute todos os procedimentos em um exaustor e com equipamento de protecção pessoal, incluindo um escudo de rosto, uma bata de laboratório e luvas. NOTA: polimerizado tecidospode ser armazenada em 0,1X PBS contendo azida de sódio durante mais de 2 semanas a 4 ° C. CUIDADO: A azida sódica é altamente e altamente tóxico. Efectuar todos os procedimentos em um exaustor e com equipamento de protecção pessoal, incluindo um escudo de rosto, uma bata de laboratório e luvas. 4. eletroforética Tissue Clearing (ETC) Transferir a amostra polimerizada a um recipiente de tecido e colocar o recipiente na câmara de tecido, etc. Encha a câmara ETC ETC com tampão usando a bomba peristatic. Defina as condições ETC e executar o ETC. Use as seguintes configurações. Para configurações etc para órgãos inteiros, utilize as seguintes definições: (1,5 AMP), temperatura (37 ° C), hora (6,0 h), a velocidade da bomba (30 rpm) em execução. Para configurações etc para grossas fatias de cérebro de rato de 1 a 2 mm, use as seguintes configurações: atual (1,5 amp), temperatura (37 ° C), hora (2,0 h), a velocidade da bomba (30 rpm) em execução. transferência tele limpou amostra para um tubo cônico de 50 mL com 45 mL de 0,1 x PBS. Lavam-se as amostras compensadas várias vezes com 0,1X PBS até não há bolhas são vistas quando o tubo é agitado brevemente (para confirmar a remoção completa do SDS). 5. imunomarcação de tecidos processados-ACT Para toda rato cérebro: incubar a amostra num volume de 3 mL de solução de anticorpo contendo 1x PBS, 6% de albumina de soro bovino (BSA), 0,1% de Triton X-100, e 0,01% de azida de sódio (solução de diluição do anticorpo) com uma diluição fator de 1/500 para a tirosina hidroxilase anticorpo (TH) durante 4 dias a 37 ° C com agitação suave. Substituir a solução de anticorpo no final do dia 2. Lava-se a amostra num tubo cónico de 50 ml com 45 ml de 0,1 x PBS durante 3 – 5 h e mudar o tampão de cada hora. Incubar a amostra num volume de 3 ml de solução de diluição do anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo secundário de burro anti-coelho de 488 durante 4 dias a 37 ° C com agitação suave. Replace as soluções anticorpo diluído no dia 2. Para a espessura 1- tecido cerebral cortado 2 mm: incubar a amostra durante a noite ou até um máximo de um dia, num volume de 0,5 a 1 mL de uma solução de diluição de anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo de colagénio do tipo IV a 37 ° C com agitação suave. Lava-se a amostra num tubo cónico de 15 mL com um volume de 12 ml de 0,1 x PBS durante 1-2 h. Alterar o buffer a cada hora. Incubar a amostra num volume de 0,5 a 1 mL de uma solução de diluição de anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para Cy3-conjugado de anticorpo secundário anti-coelho durante a noite ou até um máximo de 1 dia a 37 ° C com agitação suave. Lavar a amostra com 0,1 x PBS durante 3-5 h; mudar o tampão de cada hora. Antes de imagiologia, incubar a amostra em uma quantidade adequada de solução de montagem cúbico por 1 h à temperatura ambiente com agitação suave. Substitua com uma solução CUBIC-mount fresco e incubar durante mais 1 h. NOTA: </b> 76 Tipo de anticorpos funcionou bem no tecido processado-ACT rato, incluindo 31 anticorpos monoclonais 14. Pré-tecido marcado pode ser combinado com a imunomarcação de mais dois fluorocromos no tecido ACT-processados. 6. imunomarcação de densas tecidos (Presto) c-PRESTO NOTA: c-PRESTO é adequado para pequenos porte amostras, tais como testículo inteiro, rim inteiro, ou pequenas seções de órgãos maiores. Transferir a amostra para um tubo de 1,5 ml, adicionar 500 mL de uma solução de diluição de anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo de colagénio tipo IV, e centrifuga-se o tubo a 600 × g durante 2 h. Lava-se a amostra corada com 0,1 x PBS por centrifugação a 600 x g durante 30 min. Adicionar 500 uL de solução de diluição do anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo secundário anti-coelho conjugado com Cy3 e centrifugar a 600 x g durante 2 h. Lavar a amostra corada com 0.1x PBS por centrifugação a 600 x g durante 30 min. s-PRESTO NOTA: s-PRESTO é adequado para tecidos maiores. Prepare uma seringa (volume de 30 mL) e conectá-lo a uma válvula de 3 vias (Figura 1A). Cole a válvula com uma pistola de cola para as condições de alta pressão (Figura 1B). Transferir a amostra para a seringa conectada à válvula de 3 vias em a posição da válvula fechada. Adicionar 5 – 7 ml de solução de diluição do anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo de colagénio do tipo IV. Libertar a solução de anticorpo na amostra através da abertura da válvula. Colocar o pistão da seringa para a posição de 17 mL para proporcionar espaço suficiente para o movimento infusão / retirada. Isto pode ser feito na posição da válvula aberta. Fechar a válvula de 3 vias, após a definição seringa está terminado. Colocar a seringa que contém a amostra em uma bomba de seringa. Definir as condições de bomba de seringa a um volume de infusão / retirada de 10 ml / min e um 4-min tempo de pausa no modo de ciclo contínuo (Figura 1C). NOTA: A bomba infunde até atingir o volume alvo (10 ml), e, em seguida, a direção de fluxo de alterações após uma breve pausa (4 min). Executar a bomba de seringa, durante 3 – 24 h à temperatura ambiente (Figura 1F). Abra a válvula de 3 vias e substituir a solução com 0,1 x PBS. Lava-se a amostra corada duas vezes com 0,1 x PBS, durante 1 h cada vez usando a bomba de seringa. Mudar com solução de diluição do anticorpo contendo anticorpo secundário anti-coelho Cy3 conjugada (factor de diluição de 1/500) e executar a bomba de seringa para 3-24 h. Abra a válvula de 3 vias e substituir a solução com 0,1 x PBS. Antes de imagiologia, incubar a amostra manchado em uma quantidade adequada de solução de montagem cúbico por 1 h à temperatura ambiente com agitação suave. Substitua com uma solução CUBIC-mount fresco e incubar durante mais 1 h. 7. Imaging Coloque o tecido marcado em um prato confocal e adicionar solução CUBIC de montagem até que o tecido é coberto. Coloque uma lamela sobre o tecido. Use um microscópio confocal para a imagem do tecido 14 sob a objetiva de 10X.

Representative Results

Clearing ACT-tecidos Um fator importante que afeta a compensação de tecidos é a fixação do tecido. PFA fixação e infusão de acrilamida são etapas separadas neste protocolo. Depois do passo de polimerização do tecido de hidrogel, a solução A4P0 livre não é polimerizado, apesar de infusão de tecido hidrogéis são reticulados com macromoléculas endógenas. Portanto, não deve formar gel de fora do tecido (Figura 2A). O procedimento ACT resulta em menos reticulação entre as proteínas e acrilamida em comparação com o protocolo de clareza. Assim, a amostra de tecido de hidrogel é mais porosa. Este recurso permite a extração rápida de lipídios e a difusão de macromoléculas. As secções de cérebro de rato de 1 a 2 mm de espessura foram suficientemente afastada dentro de 1 – 2 horas (Figura 2B), e 5-6 h de etc foi suficiente para Clearance de cérebros inteiros de rato (Figura 2C). compensação de tecido mediada por Hidrogel induziu a expansão do tecido depois do passo etc, mas o tecido devolvido ao seu tamanho original, em solução pareados por índice de reflexão. A amostra de tecido de hidrogel formado no procedimento ACT é altamente porosa, e, assim, compostos pequenos e macromoléculas poderia penetrar eficientemente e difundir facilmente (Figura 3). Após 2 h de incubação de fatias de cérebro de 1 mm com tirosina-hidroxilase (TH) e o anticorpo de tipo IV do colagénio, uma subsequente de 2 horas de incubação com um anticorpo secundário era suficiente para rotular os neurónios dopaminérgicos, a uma profundidade de 500 um (Figura 3) . Imunomarcação PRESTO-tecidos órgãos densas têm, geralmente, concentrações elevadas de fibras de ECM, que afecta a penetração dos anticorpos para os tecidos. Assim, os anticorpos Penetavaliaram a uma profundidade de apenas 20-30 uM em tecidos densos, tais como o tecido renal, após 12 h de incubação. Para superar esta limitação, desenvolvemos métodos de penetração de macromoléculas activas que permitem a entrega de reagentes para os tecidos profundos, isto é, presto (pressão relacionada com a transmissão estável e eficiente de macromoléculas para os órgãos) (Figura 4). Em comparação com a incubação estática de tecido renal processado-ACT com soluções de anticorpos, a aplicação de forças centrífugas (600 xg) com uma centrífuga de mesa (PRESTO centrífuga, c-PRESTO) melhorou muito a entrega de anticorpos no tecido profundo (Figura 5). Quando aplicamos o procedimento c-PRESTO aos tecidos densos, 3 h de incubação foi suficiente para rotular 250 para estruturas profundas 300 mícrons. Para melhorar a distorção do tecido, sem dano tecidual significativa, que também projetou uma máquina que fornece fluxo de convecção com uma bomba de seringa (PRESTO seringa, s-PRESTO). Este processo igualmente melhorada pe de anticorposnetration comparada à difusão passiva (Figura 5). Figura 1. Preparação do aparelho s-presto. A. Uma seringa (30 mL) e torneira de três vias. B. A torneira de três vias conectada e colada à seringa. C. A seringa contendo a solução de amostra e o anticorpo, e a seringa colocada sobre a bomba de seringa. D. A bomba de seringa e configuração de condição de trabalho. E. A bomba de infusão de um solução contendo os reagentes de marcação para o espécime. Quando o volume designado é atingido, as mudanças de direcção de bombagem e se retira a solução após um período de tempo designado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Figura 2. ACT compensação tecido do cérebro de rato. A. Após a polimerização, as soluções A4P0 livres não são polimerizados; hidrogeles infusão de tecido são gelificado por reticulação com macromoléculas endógenas. B. 1 a fatias de cérebro de espessura de 2 mm foram apuradas para 1 – 2 h, e o grau de expansão e recuperação de tamanho em índice de reflexão (RI) solução -Correspondência foram registrados. C. A espessura de todo o cérebro do rato é de cerca de 0,8 cm e 5-6 h da ETC foi suficiente para limpar completamente o cérebro. Após 3 h de ETC, houve uma quantidade significativa de tecido não apagada. Por 6 h de ETC, no entanto, havia ocorrido compensação de todo o cérebro. A cor dos tecidos após ACT no buffer ETC é branca ou opaca. Pelo ajuste RI, os tecidos tornam-se transparentes. Por favor, clique delae para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. imunomarcação com tecido cerebral do rato limpou-ACT. Imagens de 1 mm fatias processadas-ACT cérebro do rato mostrando córtex cerebral do rato corado com um anticorpo para colágeno tipo IV e parte do mesencéfalo coradas com um anticorpo para tirosina hidroxilase (TH). barra de escala, 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura métodos imunomarcação 4. PRESTO. Os anticorpos não conseguem penetrar em tecidos densos por difusão. métodos PRESTO imunomarcação foram projetados para infundir ativamente macromoléculas e entregar reagentes paratecidos densos. A aplicação de forças centrífugas, usando uma centrífuga de bancada padrão (Presto centrífuga, c-Presto) nitidamente facilitada a entrega de anticorpos. A aplicação de fluxo de convecção com uma bomba de seringa (PRESTO seringa, s-PRESTO) melhorou a penetração do anticorpo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5. PRESTO imunomarcação de tecido denso limpou-ACT. Para C-Presto, os tecidos foram centrifugadas a 600 xg durante 3 h, usando uma centrífuga de bancada padrão, a fim de acelerar a penetração dos anticorpos primários e secundários. Para S-Presto, uma bomba de seringa foi utilizado para entregar os anticorpos. órgãos do rato, tais como os rins e do fígado, foram marcadas com colagénio de tipo IV. Comparado com os métodos convencionais, 3 h deC ou S-PRESTO marcadamente aumenta a profundidade rotulagem. No rim e fígado, a profundidade do eixo Z atinge 300-350 uM ou mais profundo em amostras presto (à direita), enquanto as amostras de controlo são rotulados a uma profundidade de apenas 40 – 50 | iM (esquerda). A imagem reconstruída 3D foi obtida com um microscópio confocal. barra de escala, 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Má fixação ou a imersão do hidrogel em tecidos pode causar a perda de proteínas e a distorção do tecido durante o processo de limpeza do tecido. Todo o cérebro do rato adulto deve ser incubada em paraformaldeído a 4% durante a noite, seguido por imersão num volume mínimo de 20 mL de solução de monómero de hidrogel para 12 – 18 h com agitação suave. Para grandes tecidos, incluindo tecidos de origem humana, tais como fatias de cérebro e medula espinal, estendido imersão tempo na solução de monómero de hidrogel é necessária. O protocolo ACT é facilmente aplicável à limpeza de tecidos fixos porque os passos de fixação de tecido e de infusão de polímero são separados. Depois de limpa de tecido, tecidos humanos foram bem coradas com vários anticorpos. Note-se que a técnica ACT compensação não é compatível com fixadores álcool, tal como etanol e metanol.

A etapa de polimerização tecido-hidrogel também é fundamental para a produção de tecidos de boa qualidade no seguimento do processo de compensação. Porqueo oxigénio inibe a polimerização de acrilamida, que deve ser removido por desgaseificação a solução contendo o tecido sob um sistema de infusão de azoto gasoso. Alternativamente, DE-oxigenação pode ser executado usando uma câmara de vácuo com um bloco de aquecimento durante 23 h.

A taxa de compensação é dependente de vários fatores, incluindo o tamanho do órgão, o conteúdo de lipídios ou proteínas fibrosas ECM, a condição de fixação, etc. A maioria dos tecidos do rato adulto pode ser afastada pelo ETC durante a noite. No entanto, há um risco desnecessário de sobre-compensação e inchaço dos tecidos; Assim, as diferenças de tempo de compensação são de consideração importante. condições tecido de limpeza deve ser determinada empiricamente. Mais importante, o conteúdo da ECM podem afectar a aparência do tecido limpo. A cor dos tecidos permanece branca ou opaca, mesmo após a ACT em tampão ETC, porque ACT não limpa fibras de proteína densas. No entanto, quando estes órgãos foram imersos em solução correspondente RI, oy se tornou transparente.

A taxa de inchamento dos tecidos parece ser dependente do conteúdo de ECM os tecidos e órgãos moles, tais como o cérebro, exibem uma proporção de inchaço superior a órgãos densas. Porque o aumento do inchaço dos tecidos vai ajudar o processo de tecido-clearing, ACT rotineiramente utiliza destilada tampão à base de água na maioria dos casos. Em alguns casos, quando o inchaço dos tecidos ou deformidade transitória não é desejável, tais como em embriões, tampão contendo 0,1 x PBS pode ser aplicada para imagens de alta resolução. Deve-se também notar-se que as concentrações mais elevadas de sal no tampão poderia causar o encolhimento dos tecidos.

O método ACT pode esclarecer órgãos inteiros e até mesmo todo o corpo de um rato 14. No entanto, processamento de imagem de tecidos profundos de tecido transparente exige microscópios e objetivos especiais. Assim, o tecido cerebral de 1 a 2 mm de espessura é mais eficaz para imagiologia com um microscópio confocal convencional. Nas nossas mãos, a remoção da etiquetaanticorpos ed dos tecidos processados-ACT é dependente de anticorpos, e rodadas de rotulagem anticorpo diferente não são recomendados. Vários anticorpos, como TH e GFAP, trabalhou especialmente bem para todo o cérebro immunolabeling 14. Por outro lado, alguns anticorpos, tais como TuJ1 ou Map2, frequentemente marcado apenas a superfície dos tecidos. Isto pode ser melhorado por outros métodos, tais como o interruptor 15. Outra limitação potencial é que pode ser difícil para preservar estruturas de proteínas finas no tecido processado-ACT devido ao inchaço dos tecidos e encolhimento durante a etapa de remoção de tecido.

A técnica presto é aplicável a uma grande variedade de técnicas de rotulagem tecido. Por exemplo, em métodos de tecido transparente usando tecido pré-marcada, como SeeDB 4 e 7 iDISCO, imunomarcação de tecido denso requer períodos de incubação mais longos do que alguns dias a semanas. No entanto, Presto pode encurtar o tempo de incubação a várias horas, enabling a realização de todo o processo dentro de um dia, com 1 mm de espessura de tecido denso. PRESTO pode melhorar a eficácia de deep-rotulagem de espessura, tecidos densos, ou tecidos grossos mesmo un-desmatadas. Porque Presto utiliza uma centrífuga de mesa ou bomba de seringa e não requer qualquer equipamento especial, é relativamente fácil de implementar esta técnica com os procedimentos laboratoriais de rotina.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).

Materials

4% Paraformaldehyde Lugen SCI  LGB-1175-4B sample fixation 
Acrylamide Affymetrix 75820 Hydrogel monomer solution 
2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride Wako Pure Chemical Industries   VA-044 Hydrogel monomer solution 
Boric acid Affymetrix 76324 ETC buffer
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix 18220 ETC buffer
Sodium hydroxide pellets Junsei chemical 1310-73-2 ETC buffer
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz Biotechnology sc-2323A Immunolabeling
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Immunolabeling
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Immunolabeling
Collagen type Ⅳ Abcam AB6586 Antibody/immunolabeling
Tyrosine hydroxylase (TH) Millipore AB152 Antibody/immunolabeling
Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-165-152 Secondary antibody/ immunolabeling
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Life Technologies – Molecular Probes A21206 Secondary antibody/ immunolabeling
Confocal dish SPL lifesciences 101350 Imaging
Confocal microscope Leica SP8 Imaging
Sucrose Junsei chemical 31365-0301 CUBIC-mount solution 
Urea Affymetrix 23036 CUBIC-mount solution 
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine Sigma-Aldrich 122262 CUBIC-mount solution 
ECT chamber Logos Biosystems, Inc. C10101 ETC system
ECT chamber controller Logos Biosystems, Inc. C10201 ETC system
Temperature probe Logos Biosystems, Inc. C12101 ETC system
Peristatic pump Baoding longer precision pump Co., Ltd YZ1515X ETC system
Buffer reservoir Logos Biosystems, Inc. C10401 ETC system
Tissue container  Logos Biosystems, Inc. C12001 ETC system
Container holder for 1 tissue container Logos Biosystems, Inc. C12002 ETC system
Mouse brain slice holder Logos Biosystems, Inc. C12004 ETC system
Whole rat brain holder Logos Biosystems, Inc. C12007 ETC system
Peristaltic pump tubing Logos Biosystems, Inc. C12104 ETC system
Tabletop-centrifuge Hanil science industrial Co., Ltd MICRO 12 c-PRESTO
Syringe pump Baoding longer precision pump Co., Ltd LSP02-1B s-PRESTO
Syringe (20 ml) Korea vaccine Co., Ltd. KV-S20 s-PRESTO
3-way stopcock Hyupsung medical Co.,Ltd. HS-T-01N s-PRESTO
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References

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Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. J. Vis. Exp. (118), e54904, doi:10.3791/54904 (2016).
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