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Biology

ACT-PRESTO: Dégagement de tissus biologiques et méthodes immunomarquage pour Volume Imaging

Published: December 31, 2016
doi:
10.3791/54904
,
1Department of Anatomy,Korea University College of Medicine

Summary

ACT-PRESTO (clarté technique pression actif transfert efficace et stable liée de macromolécules dans les organes) permet la compensation rapide des tissus, efficace, mais peu coûteux et à la pénétration rapide des anticorps dans les tissus compensés par diffusion passive ou accouchement assisté à la pression. En utilisant ce procédé, une large gamme de tissus peut être effacé, immunomarquées par des anticorps multiples et le volume imagé.

Abstract

L'identification et l'exploration de l'organisation détaillée des organes ou de tout le corps au niveau cellulaire sont des défis fondamentaux en biologie. méthodes transitoires nécessitent une quantité importante de temps et d'efforts pour obtenir une image 3D et comprenant sectionner le tissu intact, immunomarquage, et l'imagerie des tissus en série de section, qui produit une perte d'information à chaque étape du processus. Dans les approches développées récemment pour imagerie à haute résolution dans le tissu intact, la caractérisation moléculaire a été limitée à l'étiquetage des protéines. Cependant, les protocoles actuellement disponibles pour la compensation d'organes nécessitent un temps de traitement considérablement long, ce qui rend difficile à mettre en œuvre des techniques de compensation de tissu dans le laboratoire. Nous avons récemment établi un protocole rapide et hautement reproductible appelé ACT-PRESTO (a ctive c larité t echnique- p ression r exalté e FFICIENT et table de s t ransfertdes macromolécules dans rgans o), ce qui permet une clairance tissulaire à l'intérieur de plusieurs heures. Par ailleurs, ACT-PRESTO permet rapidement immunomarquage avec des procédés classiques et accélère la pénétration des anticorps dans la couche profonde de densément formées, les échantillons d'épaisseur en appliquant une pression ou d'écoulement de convection. Nous décrivons comment préparer les tissus, comment effacer par élimination des lipides par électrophorèse, et comment Immuno-tache par un accouchement assisté à la pression. La rapidité et la cohérence du protocole permettront d'accélérer la performance de la recherche histologique 3D et des diagnostics basés sur le volume.

Introduction

L'un des défis en neurosciences est la visualisation de câblage du circuit neuronal et des cellules individuelles dans les tissus du cerveau intact. Jusqu'à récemment, ce qui démontre les connexions entre les neurones de cette manière nécessaire 1) tronçonnage série de tissus; 2) marquage moléculaire des cibles spécifiques, tels que des axones ou des protéines; et 3) la visualisation par reconstruction 3D de l'ensemble du cerveau par l' intermédiaire d' enregistrement de calcul ou l' alignement des images 2D série 1. Ces étapes sont laborieux, exigent beaucoup de temps, et sont susceptibles de perdre des informations lors de la découpe et de l'étiquetage, ce qui rend la cartographie de réseau neuronal extrêmement difficile. Cependant, de nombreux procédés qui permettent la visualisation du tissu intact, sans sectionnement ont été développés. Les tissus biologiques peuvent être optiquement transparents par des techniques de dégagement du tissu 2-10. L'une des principales méthodes consiste à réduire les différences d'indice de réfraction entre le tissu intact, et la solution d'immersion dans l'ordrepour réduire la diffusion de lumière dans le tissu intact, ce qui rend le tissu transparent et permet l'observation des structures profondes. Certains types de solutions d'immersion ont des propriétés hydrophobes, ce qui entraîne une extinction rapide de fluorescence pendant le processus de déshydratation. Par conséquent, ces procédés ne sont pas compatibles avec l' imagerie de fluorescence sur une longue période de temps 11,12. Au lieu de réactifs hydrophobes, d' autres procédés utilisent des réactifs hydrophiles , pour la compensation des tissus, tels que SeeDB 4 et Sca l e 6, qui maintiennent l'information structurale et de la fluorescence du 4,6,8 tissu biologique. Cependant, les macromolécules, y compris les anticorps, ne peuvent pas atteindre le coeur du tissu intact par la diffusion seule. Par conséquent, le pré-marquage des molécules cibles dans les zones profondes de tissus à forte densité de remplissage est techniquement difficile.

Dans une méthode de dégagement du tissu récemment mis au point, CLARITY 3, un biologique i tissu hydrogel incorporés formés avec l'acrylamide, et les lipides sont éliminés par électrophorèse dans du dodécylsulfate de sodium (SDS) à une solution contenant. L'échantillon est ensuite immergé dans une solution avec un indice de réfraction correspondant pour réduire la diffusion de la lumière 3. Le système d'élimination des lipides a ensuite été modifié en CLARITY avancé 13 et PACT (technique de clarté passive) 10. Après la polymérisation, les chaînes d'acrylamide réticulent avec des protéines, formant un hydrogel tissulaire. les composants lipidiques ne peuvent réticuler avec l'acrylamide; Ainsi, les lipides peuvent être éliminés par électrophorèse dans du tampon contenant du SDS. Par l'élimination active des lipides des tissus cérébraux augmente nettement la transparence 9. Cependant, ces méthodes ne traitent pas l'impossibilité de deep-étiquetage par diffusion libre. Pour surmonter cette limitation, les techniques pour le transport actif des réactifs dans les parties les plus profondes des tissus épais sont requis.

Bien que CLARITY permet la compensation des tissus et des tissus profondsla visualisation, il est pas une procédure facile ou rapide. Il peut prendre plusieurs semaines pour effacer toute une 7,14 du cerveau de la souris. compensation rapide des tissus est essentielle pour l'application de ces méthodes aux paramètres de laboratoire de base ou cliniques pour la recherche en sciences de la vie ou le diagnostic de volume. Le protocole actuel prévoit un processus simplifié pour le dédouanement de tissus biologiques et la détection de la protéine ultérieure par la livraison immunocoloration assisté à la pression. Il est adapté pour un volume d'imagerie à haute résolution d'un grand dépôt et 3D, des systèmes de traitement de données par combinaison avec des méthodes d'imagerie.

Protocol

Les expérimentations animales doivent se conformer à toutes les réglementations gouvernementales et institutionnelles pertinentes. 1. Préparation des réactifs Pour la solution de monomère d'hydrogel (A4P0): Ajouter 20 g d'acrylamide et 450 ml de 0,1 x tampon phosphate salin (PBS) et ajuster le volume à 500 ml avec 0,1 x PBS. ATTENTION: les monomères Acrylamide sont toxiques. Effectuer toutes les procédures dans une hotte avec un équipement de protection individuelle, y compris un écran facial, une blouse de laboratoire, des gants et des chaussures fermées. Immédiatement avant l'utilisation, ajouter 100 mg de 2,2'-azobis [2- (2-imidazoline-2-yl) propane] 40 ml d'une solution de monomères d'hydrogel (A4P0) dans un tube de 50 ml conique sous une hotte . Pour la compensation des tissus électrophorétique tampon (ETC): Ajouter 40 g de dodécylsulfate de sodium (SDS) et 12,37 g d'acide borique dans 800 ml d'H 2 O déminéralisée (dH 2 O). Ajuster le pH à 8,5 avec NaOH et ajuster le volume à1 L avec dH supplémentaire 2 O. ATTENTION: SDS est un produit chimique dangereux; donc le manipuler avec soin. Pour la solution de montage CUBIQUE: ajouter 250 g de saccharose, 125 g d'urée et 125 g de N, N, N ', N' -tetrakis (2-hydroxypropyl) éthylène diamine à 150 ml de dH2Û et amener le volume 500 mL avec dH 2 O. 2. Préparation des échantillons et de fixation Euthanasie de la souris. Préparer la alfaxalone (1 mg / kg) et de xylazine (0,5 mg / kg) dans la même seringue. Intrapéritonéale injecter le mélange de alfaxalone et de xylazine et permettent 3 min de la souris pour devenir inconscient. Attendez jusqu'à ce que la souris anesthésié ne répond plus aux stimuli douloureux, comme un pincement de la queue, avant de poursuivre. ATTENTION: Suivez les directives institutionnelles appropriées pour la manipulation des animaux. Transcardiaque perfuser la souris avec 100 ml de NaCl à 0,9% (pH 7.4 à 7.5) Solutioncontenant de l' héparine (100 U / ml) , exsangue, suivi par 100 mL de 4% de paraformaldehyde (PFA) dans 1 x PBS (pH 7,4) 14. ATTENTION: solution PFA est toxique. La préparation de la solution PFA et toutes les manipulations ultérieures doit être effectuée dans une hotte et d'un équipement de protection individuelle. Coupez la tête de la souris, ouvrir la peau, et de briser le crâne entre les yeux à l'aide de petits ciseaux. Retirer les morceaux du crâne à l'aide de petites pinces incurvées. Sortez le cerveau ou les organes désirés. Incuber le cerveau et les organes en post-fix solution à 4% PFA à 4 ° C pendant la nuit. NOTE: Pour spécifique à la région de compensation de tissu, disséquer la région spécifique ou couper le tissu après la fixation du tissu. ATTENTION: solution PFA est toxique. La perfusion transcardial et toutes les manipulations ultérieures de la souris doivent être effectuées dans une hotte et d'un équipement de protection individuelle. 3. Hydrogel Monomère Infusion et Polymerization Incuber les organes fixés dans une solution de monomère d'hydrogel A4P0 à 4 ° C pendant 12 à 24 heures avec agitation douce. Hydrogel monomère perfusé polymérisation tissulaire. Transférer l'échantillon dans un tube à fond rond de 10 mL avec 5 mL d'une solution de monomère d'hydrogel. Enveloppez la partie supérieure du tube à fond rond avec du Parafilm. Éliminer l'oxygène à partir du tube à fond rond contenant de l'hydrogel infusé tout le cerveau de souris échantillon en faisant barboter de l'azote à travers le liquide pendant 1 min. fermer rapidement et hermétiquement le tube contenant l'échantillon. Transférer le tube à un bain d'eau (37 ° C) pendant 2 h. Laver l'échantillon polymérisé brièvement avec 0,1x PBS pour éliminer l'excès d'hydrogel. ATTENTION: les monomères hydrogels sont toxiques. Pour éviter le contact de la peau avec un monomère d'hydrogel, effectuer toutes les procédures dans une hotte et d'un équipement de protection individuelle, y compris un écran facial, une blouse de laboratoire, et des gants. NOTE: polymérisé tissuspeuvent être stockés dans 0,1x PBS contenant de l'azoture de sodium pendant plus de 2 semaines à 4 ° C. ATTENTION: L' azoture de sodium est très et très toxique. Effectuer toutes les procédures dans une hotte et d'un équipement de protection individuelle, y compris un écran facial, une blouse de laboratoire, et des gants. 4. électrophorétique Clearing tissulaire (ETC) Transférer l'échantillon polymérisé dans un récipient de tissu et placer le récipient de serviettes dans la chambre du CTE. Remplir la chambre d'ETC avec un tampon d'ETC en utilisant une pompe péristaltique. Définissez les conditions de l'ETC et exécuter le ETC. Utilisez les paramètres suivants. Pour les réglages de l'ETC pour des organes entiers, utilisez les paramètres suivants: (1,5 ampères), la température (37 ° C), le temps (6,0 h), la vitesse de la pompe (30 rpm) en cours d'exécution. Pour les réglages de l'ETC pour 1 à 2 mm d'épaisseur des tranches de cerveau de la souris, utilisez les paramètres suivants: courant (1,5 amp), la température (37 ° C), le temps (2,0 h), la vitesse de la pompe (30 rpm) en cours d'exécution. Transfert til a autorisé l'échantillon à un tube conique de 50 ml avec 45 ml de 0,1x PBS. Laver l'échantillon plusieurs fois défrichées avec 0,1x PBS jusqu'à ce qu'aucune bulle sont visibles lorsque le tube est brièvement secoué (pour confirmer la suppression complète de la SDD). 5. immunomarquage des tissus ACT-traitées Pour l'ensemble de cerveau de souris: Incuber l'échantillon dans un volume de 3 ml d'une solution d'anticorps contenant 1 x PBS, 6% d'albumine de sérum bovin (BSA), 0,1% de Triton X-100 et d'azoture de sodium à 0,01% (solution de dilution d'anticorps) avec une dilution facteur de 1/500 pour la tyrosine hydroxylase (TH) anticorps pendant 4 jours à 37 ° C avec agitation douce. Remplacer la solution d'anticorps à la fin du jour 2. Laver l'échantillon dans un tube conique de 50 ml avec 45 ml de 0,1x PBS pendant 3 – 5 h et changer le tampon toutes les heures. Incuber l'échantillon dans un volume de 3 ml d'une solution de dilution d'anticorps avec un facteur de dilution de 1/500 à dos d'âne anti-lapin de 488 anticorps secondaire pendant 4 jours à 37 ° C avec agitation douce. Replace les solutions d'anticorps dilué au jour 2. Pour 1 à 2 mm d'épaisseur du tissu cérébral tranché: Incuber l'échantillon pendant une nuit ou jusqu'à 1 jour en 0,5 à 1 ml de volume de solution de dilution d'anticorps avec un facteur de dilution de 1/500 pour les anticorps de type IV de collagène à 37 ° C avec une agitation légère. Laver l'échantillon dans un tube conique de 15 ml avec un volume de 12 ml de 0,1x PBS pendant 1-2 heures. Changer le tampon toutes les heures. Incuber l'échantillon dans un 0.5- à 1 ml de volume d'une solution de dilution d'anticorps avec un facteur de dilution de 1/500 pour Cy3 anti-lapin conjugué anticorps secondaire pendant la nuit ou jusqu'à 1 jour à 37 ° C avec une agitation douce. Laver l'échantillon dans 0,1x PBS pendant 3 – 5 h; changer le tampon toutes les heures. Avant imagerie, incuber l'échantillon dans une quantité appropriée de solution CUBIC-mount pendant 1 h à température ambiante sous agitation douce. Remplacer par une solution fraîche CUBIC-mount et incuber pendant 1 h. REMARQUE: </b> 76 type d'anticorps a bien fonctionné dans le tissu ACT-traité souris, y compris 31 des anticorps monoclonaux 14. Préétiqueté tissu peut être combiné avec l'immunomarquage de deux fluorochromes dans les tissus ACT-traitées. 6. immunomarquage de denses Tissues (PRESTO) c-PRESTO NOTE: c-PRESTO est adapté pour les petites dimensions des échantillons, tels que testis ensemble, le rein entier, ou de petites sections de grands organes. Transférer l'échantillon dans un tube de 1,5 ml, ajouter 500 pi de solution de dilution d'anticorps avec un facteur de dilution de 1/500 pour l'anticorps du collagène de type IV, et centrifuger le tube à 600 x g pendant 2 h. Laver l'échantillon coloré avec 0,1x PBS par centrifugation à 600 g pendant 30 min. Ajouter 500 pi de solution de dilution d'anticorps avec un facteur de dilution de 1/500 pour l'anticorps secondaire anti-lapin conjugué à Cy3 et centrifuger à 600 x g pendant 2 h. Laver l'échantillon coloré avec 0.1 x PBS par centrifugation à 600 xg pendant 30 min. s-PRESTO NOTE: s-PRESTO est adapté pour les grands tissus. Préparer une seringue (volume 30 ml) et le connecter à une vanne 3 voies (figure 1A). Collez la valve avec un pistolet à colle pour les conditions de haute pression (figure 1B). Transférer l'échantillon dans la seringue de la valve connectée à 3 voies en position de fermeture anti-retour. Ajouter 5 – 7 ml de solution de dilution d'anticorps avec un facteur de dilution de 1/500 pour l'anticorps de type IV de collagène. Libérer la solution d'anticorps dans l'échantillon par l'ouverture de la vanne. Réglez le piston de la seringue à la position de 17 mL de fournir suffisamment d'espace pour le mouvement perfusion / retrait. Ceci peut être effectué en position ouverte la vanne. Fermez la vanne 3 voies après le réglage de la seringue est terminée. Placer la seringue contenant l'échantillon sur une pompe à seringue. Fixer les conditions de la pompe à seringue à un volume d'infusion / retrait de 10 mL / min et un groupe 4-min temps de pause en mode à cycle continu (figure 1C). NOTE: La pompe infuse jusqu'à ce qu'il atteigne le volume cible (10 ml), puis la direction des changements de débit après une brève pause (4 min). Faire fonctionner la pompe de la seringue pendant 3 – 24 h à température ambiante (figure 1F). Ouvrez la vanne 3 voies et remplacer la solution avec 0,1x PBS. Laver l'échantillon coloré deux fois avec 0,1x PBS pendant 1 h à chaque fois à l'aide de la pompe seringue. Changer avec une solution de dilution d'anticorps contenant un anticorps conjugué à Cy3 anti-lapin secondaire (facteur de dilution de 1/500) et faire fonctionner la pompe de la seringue pour les 3 – 24 h. Ouvrez la vanne 3 voies et remplacer la solution avec 0,1x PBS. Avant imagerie, incuber l'échantillon coloré dans une quantité appropriée de solution CUBIC-mount pendant 1 h à température ambiante sous agitation douce. Remplacer par une solution fraîche CUBIC-mount et incuber pendant 1 h. 7. Jeforgemagie Placez le tissu marqué dans un plat confocale et ajouter CUBIC-mount solution jusqu'à ce que le tissu est couvert. Placez une lamelle sur le tissu. Utilisez un microscope confocal à l' image du tissu 14 sous l'objectif 10X.

Representative Results

Clearing ACT-tissus Un facteur important affectant la compensation des tissus est la fixation des tissus. PFA fixation et perfusion d'acrylamide sont des étapes distinctes dans ce protocole. Après l'étape de polymérisation du tissu hydrogel, la solution de A4P0 libre est non polymérisé, bien que les hydrogels de tissu infusé sont réticulées avec des macromolécules endogènes. Par conséquent, aucun gel doit former à l' extérieur du tissu (figure 2A). Les résultats de la procédure d'ACT en moins de réticulation entre protéines et acrylamide par rapport au protocole de CLARITY. Par conséquent, l'échantillon de tissu hydrogel est plus poreux. Cette fonction permet l'extraction rapide des lipides et la diffusion de macromolécules. Les sections du cerveau de souris de 1 à 2 mm d' épaisseur ont été suffisamment dégagé dans les 1 – 2 h (figure 2B), et 5-6 h de ETC était suffisante pour clearance de cerveaux entiers de souris (figure 2C). la compensation des tissus à médiation hydrogels induit l'expansion du tissu après l'étape de CTE, mais le tissu est retourné à sa taille d'origine dans la solution d'index apparié réfléchissant. L'échantillon de tissu hydrogel formé dans la procédure d'ACT est très poreux et, par conséquent, de petits composés et les macromolécules peut pénétrer efficacement et facilement diffuser (figure 3). Après 2 h d' incubation de 1 mm de tranches de cerveau avec la tyrosine hydroxylase (TH) et de l' anticorps de type IV de collagène, un subséquente 2 h d' incubation avec un anticorps secondaire était suffisant pour marquer les neurones dopaminergiques à une profondeur de 500 um (figure 3) . Immunomarquage PRESTO-tissu les organes denses ont généralement des concentrations élevées de fibres de l'ECM, ce qui affecte la pénétration des anticorps dans les tissus. Ainsi, les anticorps Penetassignée à une profondeur de seulement 20 à 30 pm dans les tissus denses, comme un tissu rénal, après 12 heures d'incubation. Pour contourner cette limitation, nous avons conçu des méthodes de pénétration des macromolécules actives qui permettent la livraison de réactifs dans les tissus profonds, à savoir PRESTO (pression liée transfert efficace et stable de macromolécules dans les organes) (Figure 4). Par rapport à l'incubation statique du tissu rénal ACT-traitées avec des solutions d' anticorps, l'application des forces centrifuges (600 xg) avec une centrifugeuse de table (PRESTO centrifuge, c-PRESTO) grandement amélioré la livraison d'anticorps dans les tissus profonds (figure 5). Lorsque nous avons appliqué la procédure c-PRESTO aux tissus denses, 3 h d'incubation était suffisante pour étiqueter 250- aux structures profondes de 300 um. Afin d'améliorer la distorsion des tissus sans dommage tissulaire important, nous avons conçu une machine qui fournit des flux de convection avec une pompe à seringue (seringue PRESTO, s-PRESTO). Ce processus amélioré de façon similaire pe d'anticorpsnetration par rapport à la diffusion passive (figure 5). Figure 1. Préparation de l'appareil PRESTO-s. A. Une seringue (30 ml) et robinet à trois voies. B. Le robinet d' arrêt à trois voies connectée et collée à la seringue. C. La seringue contenant la solution d'échantillon et de l' anticorps, et la seringue placée sur la pompe à seringue. D. La pompe seringue et la configuration de travail de condition. E. La pompe insuffle une solution contenant les réactifs de marquage dans l'échantillon. Lorsque le volume désigné est atteint, les changements de direction de pompage et retire la solution après une période de temps. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Figure 2. ACT compensation des tissus du cerveau de souris. A. Après polymérisation, les solutions de A4P0 libres ne sont pas polymérisé; hydrogels de tissu infusé sont gélifié par réticulation avec des macromolécules endogènes. B. de 1 à 2 mm d' épaisseur des tranches de cerveau ont été enlevées pendant 1 – 2 heures, et l'ampleur de l' expansion et la récupération de la taille de l'indice de réflexion (RI) Appariement solution ont été enregistrées. C. L'épaisseur de l'ensemble du cerveau de la souris est d' environ 0,8 cm, et 5-6 h d'ETC a été suffisante pour dégager complètement le cerveau. Après 3 h d'ETC, il y avait une quantité importante de tissu non-autorisé. En 6 h de ETC, cependant, la compensation de l'ensemble du cerveau avait eu lieu. La couleur des tissus après ACT dans le tampon d'ETC est blanche ou opaque. Par ajustement RI, les tissus deviennent transparents. S'il vous plaît cliquez sur sone pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. immunomarquage avec le tissu du cerveau de la souris ACT-autorisé. Des images de 1 mm de tranches de cerveau de souris traitées ACT montrant le cerveau de la souris cortex colorées avec un anticorps dirigé contre le collagène de type IV, et une partie du tronc cérébral colorées avec un anticorps dirigé contre la tyrosine hydroxylase (TH). Barre d'échelle, 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4. PRESTO méthodes d'immunomarquage. Les anticorps ne peuvent pas pénétrer dans les tissus denses par diffusion. méthodes PRESTO de immunomarquage ont été conçus pour infuser activement macromolécules et de livrer des réactifs dansdes tissus denses. L'application de forces centrifuges à l'aide d'une centrifugeuse de table standard (PRESTO centrifuge, c-PRESTO) nettement facilité la fourniture d'anticorps. Appling flux de convection avec une pompe à seringue (seringue PRESTO, s-PRESTO) l'amélioration de la pénétration de l'anticorps. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 5. PRESTO immunomarquage de tissu dense ACT-autorisé. Pour c-PRESTO, les tissus ont été centrifugés à 600 g pendant 3 h à l'aide d'une centrifugeuse de table standard afin d'accélérer la pénétration des anticorps primaires et secondaires. S-PRESTO, une pompe de seringue a été utilisé pour délivrer des anticorps. des organes tels que les souris, les reins et le foie, ont été marquées avec du collagène de type IV. Par rapport aux procédés classiques, 3 h deC ou S PRESTO améliore notablement la profondeur de marquage. Dans le rein et le foie, la profondeur de l'axe Z atteint 300-350 um ou plus profondément dans les échantillons PRESTO (à droite), alors que des échantillons témoins sont marqués à une profondeur de seulement 40 – 50 um (à gauche). Une image reconstruite en 3D a été obtenue avec un microscope confocal. Barre d'échelle, 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Une mauvaise fixation ou hydrogel immersion dans les tissus peuvent causer la perte de protéines et la distorsion du tissu au cours du processus de compensation des tissus. L'ensemble du cerveau de souris adulte devrait être mis en incubation dans du paraformaldehyde à 4% pendant une nuit, suivie d'une immersion dans un volume minimum de 20 ml d'une solution de monomère d'hydrogel pendant 12 – 18 h sous agitation douce. Pour les grands tissus, y compris les tissus humains, tels que des tranches de cerveau et de la moelle épinière, le trempage prolongé dans le temps la solution de monomère d'hydrogel est nécessaire. Le protocole d'ACT est facilement applicable à la compensation des tissus fixés parce que la fixation des tissus et la perfusion de polymère étapes sont séparées. Après compensation des tissus, des tissus humains ont été bien colorés avec plusieurs anticorps. A noter que la technique de compensation ACT est pas compatible avec les fixateurs à l'alcool, comme l'éthanol et le méthanol.

L'étape de polymérisation du tissu-hydrogel est également critique pour produire des tissus de bonne qualité suivant le processus de compensation. Carl'oxygène inhibe la polymérisation de l'acrylamide, il doit être éliminé par dégazage de la solution contenant le tissu sous un système d'injection d'azote gazeux. En variante, la désoxygénation peut être effectuée en utilisant une chambre à vide avec un bloc chauffant pendant 23 h.

Le taux de compensation dépend de nombreux facteurs, y compris la taille de l' organe, le contenu de lipides ou de protéines fibreuses ECM, l'état de fixation, etc. La plupart des tissus de souris adulte peuvent être effacées par ETC nuit. Cependant, il y a un risque d'inutiles sur-compensation et de gonflement des tissus; Ainsi, les différences de temps de compensation sont d'une considération importante. conditions Tissue-compensation doivent être déterminées empiriquement. Surtout, le contenu de l'ECM peuvent affecter l'aspect du tissu effacé. La couleur des tissus reste blanche ou opaque, même après l'ACT dans le tampon d'ETC, car ACT ne supprime pas les fibres protéiques denses. Cependant, lorsque ces organes ont été immergés dans une solution d'adaptation RI, lay est devenu transparent.

Le taux de gonflement des tissus semble être dépendant du contenu de l'ECM des tissus et des organes mous, tels que le cerveau, présentent un rapport de gonflement supérieur à des organes denses. Parce que le tissu gonflement accru aidera la procédure de dégagement du tissu, ACT régulièrement utilise des distille un tampon à base d'eau dans la plupart des cas. Dans certains cas, lorsque le gonflement des tissus ou une déformation transitoire ne sont pas souhaitables, comme dans les embryons, tampon contenant 0,1x PBS peut être appliquée pour imagerie à haute résolution. Il convient également de noter que des concentrations élevées de sel dans le tampon peuvent provoquer le rétrécissement des tissus.

La méthode d'ACT peut clarifier des organes entiers et même tout le corps d'une souris 14. Cependant, l'imagerie des tissus profonds de tissu transparent nécessite des microscopes et des objectifs spéciaux. Par conséquent, une épaisseur de tissu cérébral de 1 à 2 mm est la plus efficace pour l'imagerie par microscopie confocale classique. Dans nos mains, le retrait de l'étiquetteanticorps ed à partir de tissus d'ACT-traitée est dépendante de l'anticorps, et des tours de différents marquage d'anticorps ne sont pas recommandés. Plusieurs anticorps, tels que TH et GFAP, ont travaillé particulièrement bien pour l' ensemble du cerveau immunomarquage 14. D'autre part, certains anticorps, tels que Tuj1 ou carte2, souvent désignées seulement la surface des tissus. Cela pourrait être améliorée par d' autres méthodes, telles que le commutateur 15. Une autre limite potentielle est qu'il pourrait être difficile de préserver les structures de protéines fines dans le tissu ACT-traitée en raison du gonflement des tissus et retrait pendant l'étape de dégagement du tissu.

La technique PRESTO est applicable à une grande variété de techniques de tissus d'étiquetage. Par exemple, dans des procédés de tissu transparent en utilisant un tissu pré-étiquetés, tels que SeeDB 4 et 7 iDISCO, immunomarquage des tissus denses nécessite des périodes d'incubation plus longues de plusieurs jours à plusieurs semaines. Cependant, PRESTO peut raccourcir le temps d'incubation de plusieurs heures, enabling l'achèvement de l'ensemble du processus au sein d'un jour à 1 mm d'épaisseur des tissus denses. PRESTO peut améliorer l'efficacité de la profondeur d'étiquetage épais, tissus denses, ou les tissus épais, même non défrichées. Parce que PRESTO utilise une centrifugeuse de table ou d'une pompe de seringue et ne nécessite aucun équipement spécial, il est relativement facile à mettre en œuvre cette technique avec les procédures de laboratoire de routine.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).

Materials

4% Paraformaldehyde Lugen SCI  LGB-1175-4B sample fixation 
Acrylamide Affymetrix 75820 Hydrogel monomer solution 
2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride Wako Pure Chemical Industries   VA-044 Hydrogel monomer solution 
Boric acid Affymetrix 76324 ETC buffer
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix 18220 ETC buffer
Sodium hydroxide pellets Junsei chemical 1310-73-2 ETC buffer
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz Biotechnology sc-2323A Immunolabeling
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Immunolabeling
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Immunolabeling
Collagen type Ⅳ Abcam AB6586 Antibody/immunolabeling
Tyrosine hydroxylase (TH) Millipore AB152 Antibody/immunolabeling
Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-165-152 Secondary antibody/ immunolabeling
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Life Technologies – Molecular Probes A21206 Secondary antibody/ immunolabeling
Confocal dish SPL lifesciences 101350 Imaging
Confocal microscope Leica SP8 Imaging
Sucrose Junsei chemical 31365-0301 CUBIC-mount solution 
Urea Affymetrix 23036 CUBIC-mount solution 
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine Sigma-Aldrich 122262 CUBIC-mount solution 
ECT chamber Logos Biosystems, Inc. C10101 ETC system
ECT chamber controller Logos Biosystems, Inc. C10201 ETC system
Temperature probe Logos Biosystems, Inc. C12101 ETC system
Peristatic pump Baoding longer precision pump Co., Ltd YZ1515X ETC system
Buffer reservoir Logos Biosystems, Inc. C10401 ETC system
Tissue container  Logos Biosystems, Inc. C12001 ETC system
Container holder for 1 tissue container Logos Biosystems, Inc. C12002 ETC system
Mouse brain slice holder Logos Biosystems, Inc. C12004 ETC system
Whole rat brain holder Logos Biosystems, Inc. C12007 ETC system
Peristaltic pump tubing Logos Biosystems, Inc. C12104 ETC system
Tabletop-centrifuge Hanil science industrial Co., Ltd MICRO 12 c-PRESTO
Syringe pump Baoding longer precision pump Co., Ltd LSP02-1B s-PRESTO
Syringe (20 ml) Korea vaccine Co., Ltd. KV-S20 s-PRESTO
3-way stopcock Hyupsung medical Co.,Ltd. HS-T-01N s-PRESTO
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References

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Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. J. Vis. Exp. (118), e54904, doi:10.3791/54904 (2016).
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