Stabile Zelllinien zur Untersuchung von Proteinfunktionen, Spatiotemporal Lokalisierung und Protein Interaction Networks induzierbare LAP-getaggt

HINWEIS: Ein Überblick über die Erzeugung von induzierbaren LAP-markierten stabilen Zelllinien für jedes interessierende Protein ist in Abbildung 1 veranschaulicht und die Übersicht von LAP-tagged Protein Expression, Reinigung und Vorbereitung für die Massen Proteom – Analysen ist in Abbildung 3 dargestellt. 1. Klonierung des offenen Leserahmens (ORF) des Gens in der LAP-Tag Vector Klonierung des ORF des Gens von Interesse in den Shuttle-Vektor. Verwenden der Polymerasekettenreaktion (PCR) entweder N-terminale Fusion oder C-terminale Fusion des ORF von Interesse mit den entsprechenden attB1 und attB2 Stellen innerhalb den Primern zu amplifizieren. Siehe Tabelle 1 für die Primersequenzen und Tabelle 2 für die PCR – Bedingungen. Gel reinigt die PCR-Produkte, indem sie auf einem 1% Agarose-Gel-Lösung. Excise das verstärkte Band, die die richtige Größe aus dem Gel ist und extrahieren sie aus dem Gelstück eine DNA-g unter Verwendung vonel-Extraktions-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers. Inkubieren des gereinigten attB enthält PCR – Produkte mit einem attP enthaltenden Shuttle – Vektor und die Rekombinase , die die PCR – Produkte gemäß den Anweisungen des Herstellers zu rekombinieren in den Vektor erlaubt (siehe M aterialien Tabelle). HINWEIS: Leere Shuttle – Vektoren und LAP-Tagging – Vektoren , welche die ccd – B – Gen enthalten und in ccd B resistenten Bakterienzellen vermehrt werden (siehe Materialien Tabelle). Jedoch wird das ccdB Gen rekombiniert, wenn sich ein ORF in diese Vektoren eingeführt wird, damit Standard DH5a E. coli – Zellen verwenden , wenn Vektoren mit geklonten ORFs ausbreitet. Trans DH5 E. coli – Zellen mit 1 & mgr; l des Reaktionsprodukts und die Platte , die die transformierten Zellen auf eine Luria – Brühe (LB) Agar – Platte mit 50 mg / ml Kanamycin 13. Wählen Sie die Kanamycin-resistente Kolonien. Wachsen die ausgewählten Kolonien in LB mirdia mit 50 mg / ml Kanamycin, machen Sie eine Mini-Prep – DNA und Gen – Integration bestätigen durch DNA – Sequenzierung der Sequenzierungsprimer in Tabelle 3 aufgeführt werden. Die Übertragung des Gens von Interesse aus dem Shuttle-Vektor in das LAP-Tag Vector. Inkubieren Sie die Shuttle-Vektor, der die Sequenz überprüft Gen von Interesse ORF mit dem LAP-Tag-Vektor (pGLAP1 für N-terminale Fusion) und die Rekombinase, die die Übertragung des Gens von Interesse aus dem Shuttle-Vektor in das LAP-Tag Vektor vermittelt als enthält pro Anweisungen des Herstellers (siehe Materialien). HINWEIS: Eine Reihe von LAP / TAP – Vektoren , die basierend auf dem gewünschten Promotor verwendet werden können, Epitop-tag und N oder C-terminalen Markierungs können in Tabelle 4 gefunden werden. Transformation DH5 E. coli Zellen mit 1 & mgr; l des Reaktionsprodukts und die Platte , die die transformierten Zellen auf einer LB – Agarplatte mit 100 mg / ml Ampicillin 13. Wählen Sie das Ampicillin-resistente colonehmen. Wachsen die ausgewählten Kolonien in LB – Medium mit 100 mg / ml Ampicillin, ein DNA – Mini-Prep machen, und bestätigen Gen Integration durch DNA – Sequenzierung der Sequenzierung unter Verwendung von Primern , die in Tabelle 5. 2. Erzeugung eines induzierbaren stabilen Zelllinie, die das LAP-getaggt bekundet Gen von Interesse Wählen Sie die Zelllinie am besten geeignet für das Projekt von Interesse. Alternativ können Sie eine Wirtszelllinie aus den bestehenden Zelllinie erstellen, die konstitutiv das TetR exprimiert und enthält eine FRT-Stelle, die das LAP-markierte Gen von Interesse ermöglicht, stabil in das Genom integriert werden (siehe Materialien). Hinweis: Dieses Protokoll verwendet eine HEK293 – Zelllinie, die den TetR und einer FRT – Stelle enthält, die in -tet DMEM / F12 – Medium gezüchtet [hergestellt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) , die von Tetracycline (-tet) frei ist] 4 . Bestimmen Sie die Mindestkonzentration von Hygromycin erforderlich, um die Wirtszelllinie innerhalb 1 bis 2 wee zu tötenks nach Wirkstoffzugabe. Die Konzentration kann zwischen Wirtszelllinien, variieren mit den meisten im Bereich zwischen 100 & mgr; g / ml und 800 & mgr; g / ml. HINWEIS: HEK293 gezüchteten Zellen in -tet DMEM / F12 – Medium mit 100 ug / ml Hygromycin bei 37 ° C und 5% CO 2 werden in 1-2 Wochen absterben. Co-Transfizieren des Vektors, die der Flippase Rekombinase exprimiert (vermittelt die Integration des LAP-tagged Gen von Interesse in die FRT-Stelle innerhalb des Genoms der Zelle) mit dem LAP-markierten Vektor in HEK293 Zellen, die ein Transfektionsreagenz Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers . Verwenden Sie ein Verhältnis von 4: 1 von Rekombinase Vektor zu Vektor LAP 14. HINWEIS: Das optimale Verhältnis auf der Wirtszelllinie und Verfahren der Transfektion abhängig ist, und kann eine Titration erfordern. Ein Verhältnis von 4: 1 funktioniert gut für die meisten Zelllinien. Fügen Sie ein Mock-transfizierten Platte als Negativkontrolle. Eines Tages nach der Transfektion, ersetzen Sie die -tet DMEM / F12-Medium mit frischem Medium. Zwei Tage nach der transfectiauf, geteilte Zellen auf 25% Konfluenz. Lassen Zellen ~ 5 Stunden zu befestigen, dann Hygromycin enthaltenden -tet DMEM / F12-Medium bei der in Schritt 2.2 vorbestimmten Konzentration hinzuzufügen. Für HEK293 verwenden Zellen 100 ug / ml Hygromycin. HINWEIS: Die FRT HEK293-Zellinie enthält, enthält auch das TetR, die mit Blasticidin Widerstand verbunden ist, damit 5 & mgr; g / ml Blasticidin wird während der stabilen Zelllinie Auswahlprozess verwendet zur Auswahl für den TetR und leaky Expression zu minimieren. Ersetzen Hygromycin-haltigen -tet DMEM / F12-Medium wie nötig, bis deutliche Zellfoci erscheinen, die undurchsichtige Flecken gegen die transparente Platte ähneln. In 20 ul von Trypsin auf der jeweils Zellfoci und pipettieren auf und ab 2 mal mit einem 200 ul Pipettenspitze. Platz Zellen in einer 24-Well-Platte und erweitern Sie die Zellen durch kontinuierliches Wachstum in Hygromycin enthaltenden -tet DMEM / F12-Medium. Screen-Zellen für die induzierbare LAP-markierten Proteinexpression durch Fest Zelle oder Live-Zell-Fluoreszenzmikroskopie und / oderWestern – Blot für das GFP – Tag innerhalb des LAP-tag 15. 3. Reinigung von LAP-markierten Proteinkomplexe HINWEIS: Die folgenden LAP-markierte Protein Reinigungsprotokoll Details Empfehlungen über die Bedingungen und für einen typischen LAP-markierten Proteinreinigung auf früheren Erfahrungen basiert, verwendet Bände. Vorsicht sollte jedoch ausgeübt werden, um sicherzustellen, dass empirische Optimierung für jede Proteinkomplex und Proteinexpressionsniveau von Interesse, die besten Ergebnisse liefern durchgeführt. Zellwachstum und die Zellernte. Erweitern des validierten LAP-markierten Zelllinie für die TAP Isolierung von Proteinkomplexen durch kontinuierlich Passagierung alle HEK293 – Zellen in größeren Platten und / oder Rollflaschen in -tet DMEM / F12 – Medium bei 37 ° C und 5% CO 2. Für Tet / Dox induzierbare Zelllinien induzieren für 10-15 h bei einer Konzentration von 0,2 ug / ml Tet / Dox, wenn die Zellen erreichen ~ 70% Konfluenz vor Harg Zellen. HINWEIS: Die Konzentration und die Induktionszeit sollte für jedes Protein eine Titration von 0,1-1 ug / ml Tet / Dox für 10-15 h bestimmt werden empfohlen. Ernten Sie die Zellen durch Rühren oder Trypsinierung und Pellet-Zellen bei 875 × g für 5 bis 10 min. Kupplung Anti-GFP Antikörper an Protein A Beads Verwenden Sie 40 ug Antikörper für die Immunpräzipitation von einem aus einer 0,5 ml Zellpellet hergestellt Lysat, Hämatokrit (PCV). HINWEIS: Die Menge des Antikörpers auf die Abundanz abhängig von der LAP-tagged Protein unter anderem benötigt wird, und wird die Optimierung erfordern. Eine Titration von 10 bis 40 & mgr; g empfohlen. Äquilibrieren 160 ul gepacktes Volumen (PV) Protein A-Kügelchen in PBST (PBS + 0,1% Tween-20) in einem 1,5 ml Röhrchen. Wasche 3mal mit je 1 ml PBST. HINWEIS: Alle Waschungen hierin durchgeführt werden, indem die Kügelchen bei 5,000 xg Zentrifugation für 10 sec. Resuspendieren Perlen in 500 ul PBST und fügen Sie 80 ug Affinität-purified Kaninchen-Anti-GFP-Antikörper in jedes Röhrchen 160 & mgr; l Kügelchen. Mischung für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT). Waschen Sie Perlen 2 mal mit 1 ml PBST. Dann waschen beads 2 mal mit 1 ml 0,2 M Natriumborat, pH 9 (20 ml 0,2 M Natriumborat + 15 ml 0,2 M Borsäure). Nach dem letzten Waschen, fügen 900 ul der 0,2 M Natriumborat, pH 9, um das Endvolumen auf 1 ml zu bringen. Füge 100 & mgr; l von 220 mM Dimethylpimelimidat (DMP) in einer Endkonzentration von 20 mM. Drehen Sie die Rohre vorsichtig bei RT für 30 min. Für 220 mM DMP resuspendieren Inhalt einer 50 mg-Flasche in 877 ul 0,2 M Natriumborat, pH 9 und sofort auf die Beadsuspension hinzuzufügen. Nach Inkubation mit DMP, wasche beads 1 Mal mit 1 ml 0,2 M Ethanolamin, 0.2 M NaCl, pH 8,5, die restlichen Vernetzer zu inaktivieren. Resuspendieren Kügelchen in 1 ml des gleichen Puffers und drehen 1 h bei RT. Pellet Perlen und resuspendieren Perlen in 500 ul 0,2 M Ethanolamin, 0,2 M NaCl pH 8,5. Perlen sind stabil für several Monate bei 4 ° C. Herstellung der Puffer für Zellyse und Komplexe Reinigung Bereiten Sie LAPX Puffer (wobei X die gewünschte Salzkonzentration [mM KCl] des LAP-Puffer, 300 mM für Zell-Lyse, 200 mM für die meisten Perle wäscht und 100 mM zum Waschen Perlen vor Proteine ​​eluting) durch einen pH-Wert 7,4 Lösung machen enthaltend 50 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), X mM KCl, 1 mM Ethylenglykol – tetraessigsäure (EGTA), 1 mM MgCl 2 und 10% Glycerin. HINWEIS: Die Komponenten dieses Puffers werden verwendet, um die Umgebung in lebenden Zellen zu approximieren. HEPES als Puffer im pH-Wut von 7,2-8,2 verwendet. KCl ist ein Salz verwendet, um die Ionenstärke des Puffers zu halten. EGTA ist ein chelatbildendes Mittel, das Calciumionen bindet die Mengen an Calcium gegenüber Magnesium zu reduzieren. Glycerol und MgCl 2 verwendet , um die Stabilität von Proteinen zu verbessern. Bereiten Sie LAPX N Puffer durch Zugabe von 0,05% Nonylphenol phenoxypolyethoxylethanol zum LAPX Puffer. HINWEIS: Nonyl phenoxypolyethoxylethanol ist ein mildes Detergens, das Proteine ​​solubilisiert, aber bewahrt Protein-Protein-Wechselwirkungen, wodurch eine höhere Konzentration während des Extraktionsverfahrens verwendet wird, und es wird dann während des Bindungs- und Waschschritte verringert. Herstellung von Zelllysaten Resuspendieren 500 ul PCV in 2,5 ml LAP300 mit 0,5 mM Dithiothreitol (DTT) und Protease-Inhibitoren. In 90 ul 10% Nonylphenol phenoxypolyethoxylethanol (0,3% final) und mischen durch Umdrehen. Auf Eis für 10 min. Zentrifuge bei 21.000 g für 10 min. Sammeln Sie diese niedriger Geschwindigkeit Überstand (LSS). Nehmen Sie eine 10 ul Probe des LSS für Gel-Analyse. LSS übertragen auf eine TLA100.3 Rohr und Spin bei 100.000 × g für 1 Stunde bei 4 ° C. Sammeln Sie diese Hochgeschwindigkeitsüberstand (HSS), in einem Rohr und auf Eis. Nehmen Sie eine 10 ul Probe des HSS für Gel-Analyse. HINWEIS: Vermeiden Sie die oberste Lipidschicht eine Einnahmed die unterste Zelltrümmer Schicht. Die Lipidschicht sollte vor dem Sammeln der HSS durch Vakuum abgesaugt werden. Erste Affinity-Capture: Die Bindung an Anti-GFP-Beads Pre-eluieren Antikörper gekoppelten Kügelchen (Verwendung 160 & mgr; l Kügelchen pro 0,5 ml Zellpellet (PCV)) , indem sie 3 – mal mit 1 ml Elutionspuffer [3,5 M MgCl 2 mit 20 mM Tris, pH 7,4] Waschen von ungekoppelten loszuwerden Antikörper und reduzieren Hintergrund. Haben schnell. Sie nicht für eine lange Zeit Perlen in hohen Salz verlassen. Waschen Perlen 3 – mal mit 1 ml LAP200 N. Mischungs HSS mit Antikörper-Perlen für 1 h Extrakts bei 4 ° C. Zentrifuge bei 21.000 g für 10 min. Nehmen Sie eine 10 ul – Probe des Überstandes ( das heißt die Strömung durch (FT)) für Gelanalyse. Waschen Perlen 3mal mit 1 ml LAP200 N mit 0,5 mM DTT und Proteaseinhibitoren. Waschen beads 2 mal (jeweils 5 min) mit 1 ml LAP200 N mit 0,5 mM DTT und Proteaseinhibitoren. Waschen Sie schnell 2 times mit 1 ml LAP200 N mit 0,5 mM DTT und keine Protease – Inhibitoren vor der Tabakätzvirus (TEV) Protease – Zugabe. TEV-Spaltung Verdünne 10 & mgr; g TEV Protease in 1 ml N LAP200 und drehen Röhrchen bei 4 ° C über Nacht. HINWEIS: Dieser Schritt kann für jede LAP-tagged Protein optimiert werden, in wenigen Stunden abgeschlossen werden, indem die Konzentration der TEV-Protease Einstellung, die die Erhaltung der LAP-tagged Protein-Komplexe unterstützen kann. Pellet Perlen und Überstand in ein frisches Röhrchen. Spülen Sie Perlen zweimal mit 160 & mgr; l LAP200 N mit 0,5 mM DTT und Proteaseinhibitoren (triple – Konzentration) restliche Protein zu entfernen. Nehmen Sie eine 10 ul-Probe des Überstandes für Gel-Analyse. Zweite Affinity Aufnahme: Die Bindung an S-Protein-Agarose Waschen 1 Röhrchen von 80 & mgr; l S – Protein – Agarose – Aufschlämmung (40 & mgr; l gepackte Harz) 3 – mal mit 1 ml N LAP200. HINWEIS: S Protein Bindung an den S-tag eine aktive RNase und einer alternativen zweiten Epitopmarkierung rekonstituieren sollte für RNA enthaltende Proteinkomplexe angesehen werden. In TEV eluiert Überstand S-Protein-Agarose-Perlen und Rock für 3 Stunden bei 4 ° C. Pellet Perlen und waschen 3 Mal mit 1 ml LAP200 N mit 0,5 mM DTT und Proteaseinhibitoren. Waschen Sie Perlen 2 mal mit 1 ml LAP100. Proteinelution Eluieren Proteinen aus S-Protein-Agarose durch 50 ul 4x Laemmli-Probenpuffer und Wärme Zugabe für 10 min bei 97 ° C. HINWEIS: Die Proteine können auch aus den Kügelchen mit Elutionspuffer (3,5 M MgCl 2 mit 20 mM Tris, pH 7,4) eluiert werden. 4. Identifizieren Proteine ​​durch Massenspektrometrie-Analyse Interacting Testen der Qualität der Reinigung durch die gesammelten Proben durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert, Silberfärbung des Gels (siehe <strong> Materials Table) und der Eluate Immunoblotting mit anti-GFP – Antikörper Sondieren , um sicherzustellen , daß die LAP-tagged Reinigung 16 gearbeitet, siehe Figur 4. Zur Identifizierung von stöchiometrischen und unterstöchiometrischen Co-Reinigung von Spezies, um die endgültige Elution Probe und trennen es durch SDS-PAGE. Stain das Gel mit einem Massenspektrometrie kompatibel Protein Fleck. Auszuschneiden die prominentesten Bands und den Raum zwischen ihnen von dem Gel und verarbeiten sie für die Analyse durch Massenspektrometrie getrennt 16. HINWEIS: Es gibt zahlreiche Ansätze für die abschließende Reinigung Eluate abgetrennt und für die Massenspektrometrie 5 vorbereitet. Zum Beispiel LAP-gereinigten Komplexe können durch Verwendung von Hochsalz (3,5 M MgCl 2) und der gesamten Proteinpopulation aus S-Protein – Kügelchen eluiert werden en masse durch Massenspektrometrie 17 analysiert werden kann. Alternativ können endgültige Eluate für 1 mm durch SDS-PAGE und einer einzigen 1 mm Band kann e getrennt werden seinxcised und analysiert. Dies löscht die komplexe Mischung aus jeder Perlen oder Partikeln, die mit der Analyse stören.