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Induzíveis linhas celulares estáveis ​​marcado-LAP para investigar a função da proteína, Spatiotemporal Localização e redes de interação de proteínas

Published: December 24, 2016
doi:
10.3791/54870
, , , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of California, Los Angeles, 2Molecular Biology Institute,University of California, Los Angeles, 3Jonsson Comprehensive Cancer Center,University of California, Los Angeles

Summary

We describe a method for generating localization and affinity purification (LAP)-tagged inducible stable cell lines for investigating protein function, spatiotemporal subcellular localization and protein-protein interaction networks.

Abstract

Multi-protein complexes, rather than single proteins acting in isolation, often govern molecular pathways regulating cellular homeostasis. Based on this principle, the purification of critical proteins required for the functioning of these pathways along with their native interacting partners has not only allowed the mapping of the protein constituents of these pathways, but has also provided a deeper understanding of how these proteins coordinate to regulate these pathways. Within this context, understanding a protein’s spatiotemporal localization and its protein-protein interaction network can aid in defining its role within a pathway, as well as how its misregulation may lead to disease pathogenesis. To address this need, several approaches for protein purification such as tandem affinity purification (TAP) and localization and affinity purification (LAP) have been designed and used successfully. Nevertheless, in order to apply these approaches to pathway-scale proteomic analyses, these strategies must be supplemented with modern technological developments in cloning and mammalian stable cell line generation. Here, we describe a method for generating LAP-tagged human inducible stable cell lines for investigating protein subcellular localization and protein-protein interaction networks. This approach has been successfully applied to the dissection of multiple cellular pathways including cell division and is compatible with high-throughput proteomic analyses.

Introduction

To investigate the cellular function of an uncharacterized protein it is important to determine its in vivo spatiotemporal subcellular localization and its interacting protein partners. Traditionally, single and tandem epitope tags fused to the N or C-terminus of a protein of interest have been used to facilitate protein localization and protein interaction studies. For example, the tandem affinity purification (TAP) technology has enabled the isolation of native protein complexes, even those that are in low abundance, in both yeast and mammalian cell lines1,2. The localization and affinity purification (LAP) technology, is a more recent development that modifies the TAP procedure to include a localization component through the introduction of the green fluorescent protein (GFP) as one of the epitope tags3. This approach has given researchers a deeper understanding of a protein’s subcellular localization in living cells while also retaining the ability to perform TAP complex purifications to map protein-protein interaction networks.

However, there are many issues associated with the use of TAP/LAP technologies that has hampered their widespread use in mammalian cells. For example, the length of time that is necessary to generate a stable cell line expressing a TAP/LAP tagged protein of interest; which typically relies on cloning the gene of interest into a viral vector and selecting single cell stable integrants with the desired expression level. Additionally, many cellular pathways are sensitive to constitutive protein overexpression (even at low levels) and can arrest cells or trigger cell death over time making the generation of a TAP/LAP stable cell line impossible. These and other constraints have impeded LAP/TAP methodologies from becoming high-throughput systems for protein localization and protein complex elucidation. Therefore, there has been considerable interest in the development of an inducible high-throughput LAP-tagging system for mammalian cells that takes advantage of current innovations in cloning and cell line technologies.

Here we present a protocol for generating stable cell lines with Doxycycline/Tetracycline (Dox/Tet) inducible LAP-tagged proteins of interest that applies advances in both cloning and mammalian cell line technologies. This approach streamlines the acquisition of data with regards to LAP-tagged protein subcellular localization, protein complex purification and identification of interacting proteins4. Although affinity proteomics utilizes a wide range of techniques for protein complex elucidation5, our approach is beneficial for expediting the identification of these complexes and their native interaction networks and is amenable to high-throughput protein tagging that is necessary to investigate complex biological pathways that contain a multitude of protein constituents. Key to this approach are advancements in cloning strategies that enable high fidelity and expedited cloning of target genes into an array of vectors for gene expression in vitro, in various organisms like bacteria and baculovirus, and in mammalian cells6,7. Additionally, the ORFeome collaboration has cloned thousands of sequence validated open reading frames in vectors that incorporate these advances in cloning, which are available to the scientific community8-11. In our system, the pGLAP1 LAP-tagging vector enables the simultaneous cloning of a large number of clones, which facilitates high-throughput LAP-tagging. This expedited cloning procedure is coupled to a streamlined approach for generating cell lines with LAP-tagged genes of interest inserted at a single pre-determined genomic locus. This makes use of cell lines that contain a single flippase recognition target (FRT) site within their genome, which is the site of integration for LAP-tagged genes. These cell lines also express the tetracycline repressor (TetR) that binds to Tet operators (TetO2) upstream of the LAP-tagged genes and silences their expression in the absence of Dox/Tet. This allows for Dox/Tet inducible expression of the LAP-tagged protein at any given time. Having the capability of inducible LAP-tagged protein expression is critical, since many cellular pathways are sensitive to the levels of critical proteins governing the pathway and can arrest cell growth or trigger cell death when these proteins are constitutively overexpressed, even at low levels, making the generation of non-inducible LAP-tagged stable cell lines impossible12.

Protocol

NOTA: Uma visão geral da criação de linhas celulares estáveis marcado com LAP indutíveis para qualquer proteína de interesse é ilustrada na Figura 1 e a descrição da expressão da proteína LAP-tag, purificação e preparação para proteómica análises de massa está ilustrado na Figura 3. 1. Clonagem do quadro de leitura aberta (ORF) do gene de interesse para a Vector LAP-tag A clonagem do ORF do gene de interesse no vector vaivém. Use reacção em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar o ORF de interesse com os sítios attB1 e attB2 adequado dentro dos iniciadores para qualquer fusão do terminal N ou do terminal C de fusão. Ver tabela 1 para sequências de iniciador e Tabela 2 para as condições de PCR. Gel de purificar os produtos de PCR por resolvê-los sobre um gel de agarose a 1%. Extirpar a banda amplificada que é o tamanho correto do gel e extraí-lo a partir da fatia de gel utilizando um DNA gKit de extração el conforme as instruções do fabricante. Incubar a attB purificada contendo produtos de PCR com um vector de transporte contendo attP e da recombinase que permite que os produtos de PCR para recombinar no vector de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela MATERIAIS). NOTA: vectores de transporte vazios e LAP-tagging vectores contêm o gene CCD B e têm de ser propagado em células bacterianas resistentes CCD B (ver Materiais Tabela). No entanto, o gene ccdB é recombinado para fora, quando uma ORF é inserido nestes vectores, por conseguinte, utilizar células de E. coli DH5a de E. padrão quando propagação vectores com ORFs clonados. Transformar células DH5a de E. coli com 1 uL do produto da reacção e a placa das células transformadas para um caldo de Luria (LB) com placa de agar de 50 mg / ml de canamicina 13. Selecione as colónias resistentes canamicina. Deixar crescer as colónias seleccionadas em LB mimdiâmetro com 50 mg / ml de canamicina, fazer um ADN de mini-prep e confirmar a integração do gene por sequenciação de ADN utilizando os iniciadores de sequenciação listados na Tabela 3. Transferir o gene de interesse a partir do vector de transporte para o Vector LAP-tag. Incubar o vector de transporte que contém o gene da sequência verificada de interesse ORF com o vector de LAP-tag (pGLAP1 para a fusão do terminal N) e a recombinase que medeia a transferência do gene de interesse a partir do vector vai-vem no vector LAP-tag conforme instruções do fabricante (ver Materiais). NOTA: Uma série de vectores de LAP / TAP que podem ser utilizados com base no promotor desejado, epitopo-marcador, e N ou C-terminal de marcação podem ser encontrados na Tabela 4. Transformar células DH5a de E. coli com 1 uL do produto da reacção e a placa de células transformadas para uma placa de agar LB com 100 mg / ml de ampicilina 13. Selecione o colo resistentes a ampicilinasas. Crescer as colónias seleccionadas em meio LB com 100 mg / ml de ampicilina, fazer um ADN de mini-preparação, e confirmar a integração do gene por sequenciação de ADN utilizando os iniciadores de sequenciação listados na Tabela 5. 2. Geração de uma linha celular estável Induzível que expressa o gene marcado-LAP de Interesse Selecione a linha celular mais adequado para o projecto de interesse. Alternativamente, criar uma linha de célula hospedeira a partir de qualquer linha celular que expresse constitutivamente existente a TetR e contém um local DRF que permite que o gene marcado com LAP de interesse a ser estavelmente integrado no genoma (ver Materiais). NOTA: Este protocolo utiliza uma linha celular HEK293 que contém o TetR e um local DRF, que é crescido em -Tet meio DMEM / F12 [feitas com soro de bovino fetal a 10% (FBS) que é desprovido de tetraciclina (-Tet)] 4 . Determinar a concentração mínima de higromicina necessária para matar a linha celular hospedeira dentro de 1 a 2 altasks após a adição de drogas. A concentração pode variar entre linhas de células hospedeiras, com mais que varia entre 100 ug / ml e 800 ug / ml. NOTA: as células HEK293 cultivadas em meio DMEM -Tet / F12 com 100 ug / ml de higromicina a 37 ° C e 5% de CO 2 morrem dentro de 1-2 semanas. Co-transfectar o vector que expressa a recombinase flipase (medeia a integração do gene LAP-marcadas de interesse no local DRF no genoma da célula) com o vector marcada com LAP em células HEK293 usando um reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante . Use uma proporção de 4: 1 de vector recombinase para vector LAP 14. NOTA: A proporção óptima depende da linha celular hospedeira e método de transfecção, e pode necessitar de uma titulação. Uma proporção de 4: 1 funciona bem para a maioria das linhas celulares. Incluir uma placa falsamente transfectadas como controlo negativo. Um dia após a transfecção, substituir o media / F12 -Tet DMEM com meios frescos. Dois dias pós-transfection, dividir células a 25% de confluência. Permitir que as células ~ 5 horas para anexar, em seguida, adicione higromicina contendo -Tet DMEM media / F12 na concentração pré-determinada no passo 2.2. Para utilizar células HEK293 100 ug / ml de higromicina. NOTA: O FRT contendo linha celular HEK293 que também contém a TetR que está associada com a resistência à blasticidina, portanto, 5 ug / ml de Blasticidina é utilizado durante o processo de selecção de linhas de células estáveis ​​para seleccionar para a TetR e para minimizar a expressão gotejante. Substitua higromicina contendo -Tet DMEM media / F12 conforme necessário até que focos de células distintas aparecem que se assemelham pontos opacos contra a placa transparente. Adicionar 20 ul de tripsina em cima uns dos focos das células e pipetar para cima e para baixo 2 vezes com uma ponta de pipeta de 200 uL. Células lugar em uma placa de 24 poços e expandir as células por crescimento contínuo em higromicina contendo -Tet DMEM media / F12. células de tela para a expressão da proteína etiquetada-LAP inducible por microscopia de fluorescência de células fixas ou em células vivas, e / ouWestern blot para a tag GFP dentro do LAP-tag 15. 3. Purificação de complexos de proteínas marcadas com LAP Nota: Os seguintes purificação de proteínas detalhes do protocolo recomendações lap-marcados sobre as condições e os volumes utilizados para a purificação de proteínas LAP-tag típica com base na experiência anterior. No entanto, devem ser tomadas precauções para assegurar que a optimização empírica é levada a cabo por qualquer complexo de proteína e proteína nível de expressão de interesse para proporcionar os melhores resultados. Crescimento celular e de colheita de células. Expandir a linha de células marcadas com LAP validado para o isolamento de complexos de proteínas TAP, por passaging continuamente todas as células HEK293 em placas maiores e / ou frascos rotativos em meio DMEM -Tet / F12 a 37 ° C e 5% de CO 2. Para as linhas celulares indutíveis Tet / Dox, induzir durante 10-15 horas a uma concentração de 0,2 ug / ml de Tet / Dox quando as células atingem ~ 70% de confluência, antes de Harvestcélulas de g. NOTA: O tempo de concentração e de indução deve ser determinado para cada proteína, uma titulação de 0,1-1 ug / ml Tet / Dox durante 10-15 horas é recomendado. Células colheita por agitação ou células tripsinização e pelotas em 875 g durante 5-10 min. Acoplamento de anti-GFP de anticorpos para uma proteína de grânulos Usar 40 jig de anticorpo para a imunoprecipitação de um ligado preparado a partir de um sedimento de células de 0,5 ml, o volume de células compactadas (PCV). NOTA: A quantidade de anticorpo necessária dependerá da abundância da proteína marcada com LAP, entre outros factores, e vai requerer optimização. Uma titulação de 10-40 ug é recomendado. Equilibrar 160 ul volume empacotado (PV) esferas de Proteína A em PBST (PBS + 0,1% de Tween-20) em um tubo de 1,5 ml. Lavar 3 vezes com 1 ml de PBST. Nota: Todas as lavagens aqui descritos são realizados por centrifugação das esferas a 5000 xg durante 10 seg. grânulos Ressuspender em 500 ul PBST e adicionar 80 mg de afinidadeanticorpo anti-GFP coelho -purified a cada tubo de 160 contas de ul. Mistura-se durante 1 hora à temperatura ambiente (TA). Lavar as esferas 2 vezes com 1 ml de PBST. Em seguida, os grânulos lavar 2 vezes com 1 ml de borato de sódio 0,2 M, pH 9 (20 ml 0,2 M de borato de sódio de ácido bórico + 15 ml de 0,2 M). Após a lavagem final, adicionar 900 ul do borato de sódio 0,2 M, pH 9 para levar o volume final de 1 ml. Adicionar 100 ul de 220 mM dimethylpimelimidate (DMP) a uma concentração final de 20 mM. Rodar os tubos suavemente à temperatura ambiente durante 30 min. Para DMP 220 mM, ressuspender conteúdo de um frasco de 50 mg em 877 ul de borato de sódio 0,2 M, pH 9 e adicione imediatamente a suspensão de pérolas. Após incubação com DMP, grânulos lavar uma vez com 1 ml de etanolamina a 0,2 M, NaCl 0,2 M pH 8,5, para inactivar o agente de reticulação residual. Ressuspender as pérolas em 1 ml do mesmo tampão e girar durante 1 h à TA. grânulos de pellets e contas ressuspender em 500 mL de 0,2 M de etanolamina, 0,2 M NaCl pH 8.5. Grânulos são estáveis ​​por several meses a 4 ° C. Preparação de tampões para Lise Celular e Purificação Complex Prepare buffers LAPX (onde X é a concentração de sal desejado [KCl] do tampão LAP; 300 mm para a lise celular, de 200 mm para a maioria das lavagens de contas, e 100 mm para esferas de lavagem antes de eluição proteínas), fazendo uma solução pH 7.4 contendo mM de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazina 50 (HEPES), KCl X mM, 1 mM de ácido etileno-glicol-tetraacético (EGTA), 1 mM de MgCl2, e 10% de glicerol. NOTA: Os componentes deste tampão é utilizada para aproximar o ambiente em células vivas. HEPES é usado como um tampão na raiva de 7,2-8,2 pH. KCl é um sal utilizado para manter a força iónica do tampão. EGTA é um agente quelante que se liga a iões de cálcio para reduzir os níveis de cálcio em relação ao magnésio. Glicerol e MgCl 2 são utilizados para melhorar a estabilidade das proteínas. Preparar tampão LAPX N através da adição de 0,05% de nonil phenoxypolyethoxylethanol para o buffer LAPX. NOTA: nonilo phenoxypolyethoxylethanol é um detergente suave que solubiliza as proteínas, mas preserva as interacções proteína-proteína, assim, uma concentração mais elevada é usada durante o processo de extracção e, em seguida, é reduzido durante os passos de ligação e de lavagem. Preparação de Lisados ​​celulares Ressuspender 500 ul de PCV em 2,5 ml de LAP300 com ditiotreitol 0,5 mM (DTT) e inibidores da protease. Adicionar 90 mL de 10% phenoxypolyethoxylethanol nonil (0,3% final) e misturar por inversão. Colocar em gelo durante 10 min. Centrifugar a 21000 xg durante 10 min. Recolha este sobrenadante baixa velocidade (LSS). Tomar 10 ul do LSS para análise em gel. Transferir para um tubo de LSS TLA100.3 e centrifugação a 100.000 xg durante 1 h a 4 ° C. Recolha este sobrenadante de alta velocidade (HSS), num tubo e colocar em gelo. Tomar 10 ul do HSS para análise em gel. NOTA: Evite tomar o topo de uma camada mais lipídicad a camada mais inferior restos celulares. A camada de lípido deve ser removido por aspiração a vácuo antes da recolha do HSS. Primeiro de captura por afinidade: ligação a esferas anti-GFP -Eluir Pré anticorpo acoplado grânulos (use 160 ul de contas por 0,5 mL de sedimento de células (PCV)), lavando-se 3 vezes com 1 ml de tampão de eluição [3,5 M de MgCl2 com Tris 20 mM, pH 7,4] para se livrar de desacoplado anticorpos e reduzir o fundo. Faze-o depressa. Não deixe grânulos em alta sal por um longo tempo. Lavar as esferas 3 vezes com 1 ml de N LAP200. Misture HSS extrai-se com esferas de anticorpo durante 1 hora a 4 ° C. Centrifugar a 21000 xg durante 10 min. Retirar uma amostra de 10 ul do sobrenadante (isto é, o fluxo de passagem (FT)) para análise em gel. Lavar as esferas 3 vezes com 1 ml de N LAP200 com inibidores 0,5 mM de DTT e inibidores da protease. Lavar as esferas 2 vezes (5 min cada) com 1 ml de N LAP200 com inibidores 0,5 mM de DTT e inibidores da protease. Lave rapidamente 2 tIMEs com 1 ml de N LAP200 com DTT 0,5 mM e não há inibidores de protease antes de adicionar a protease do virus da gravura do tabaco (TEV). TEV clivagem Dilui-se 10 ug protease TEV em 1 ml de N LAP200 e rodar os tubos a 4 ° C durante a noite. NOTA: Este passo pode ser optimizado para qualquer proteína marcada com LAP para ser completada em poucas horas, ajustando a concentração de protease de TEV, que pode auxiliar a preservação de complexos de proteínas marcadas com LAP. grânulos de pellets e transferência de sobrenadante para um novo tubo. Lavar duas vezes com esferas de 160 ul LAP200 N com DTT 0,5 mM e inibidores de protease (concentração tripla) para remover qualquer proteína residual. Retirar uma amostra de 10 ul do sobrenadante para análise em gel. Em segundo lugar captura por afinidade: A ligação a Proteína S agarose Lavar um tubo de 80 ul de suspensão de agarose a proteína S (40 ul embalado resina) 3 vezes com 1 ml de N LAP200. NOTA: prot Sein ligação ao S-tag vai reconstituir uma RNase activa e uma segunda marca alternativa epitopo devem ser considerados para complexos de proteína RNA contendo. Adicionar TEV eluída sobrenadante para S contas de agarose de proteína e rock durante 3 horas a 4 ° C. Grânulos de pellets e lavar 3 vezes com 1 ml de N LAP200 com inibidores 0,5 mM de DTT e inibidores da protease. Lavar as esferas 2 vezes com 1 ml de LAP100. a eluição da proteína Eluir proteínas fora proteína S de agarose através da adição de 50 ul de tampão de amostra de Laemmli 4x e aquece-se a 97 ° C durante 10 min. NOTA: As proteínas também podem ser eluídos a partir das pérolas com tampão de eluição (3,5 M com MgCl2 20 mM Tris, pH 7,4). 4. identificar proteínas que interagem por Espectrometria de Massa de Análise Testar a qualidade da purificação por meio da análise das amostras colhidas por electroforese em dodecil sulfato de sódio em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), coloração com prata do gel (ver <strong> Materiais Tabela) e por imunotransferência dos eluatos e sondagem com anticorpos anti-GFP para assegurar que a purificação marcado com LAP trabalhou 16, ver Figura 4. Para identificar as espécies co-purificação estequiométrico e subestequiométricas, pegue a amostra final de eluição e separá-lo por SDS-PAGE. Manchar o gel com uma mancha de proteína compatível espectrometria de massa. Extirpar as bandas mais proeminentes e o espaço entre eles a partir do gel e processá-los para análise por espectrometria de massa separadamente 16. NOTA: Existem várias abordagens para separar os eluatos finais de purificação e preparando-os para a espectrometria de massa 5. Por exemplo, complexos purificados-LAP pode ser eluída a partir de pérolas de proteína S através da utilização de sal elevado (3,5 M MgCl 2) e toda a população de proteínas em massa pode ser analisado por espectrometria de massa 17. Em alternativa, os eluatos finais pode ser separada por um milímetro por SDS-PAGE e uma única banda de 1 milímetro e pode serxcised e analisados. Isto elimina a mistura complexa de quaisquer grânulos ou partículas em suspensão que possam interferir com a análise.

Representative Results

Para realçar a utilidade deste sistema, o quadro de leitura aberta (ORF) da proteína de ligação de tau dos microtúbulos foi clonado no vector vai-vem através da amplificação do Tau ORF com iniciadores contendo locais de attB1 e attB2 (Tabela 1) e incubando os produtos de PCR com o vector de transporte e uma recombinase que medeia a inserção de produtos de PCR no vector de transporte. Os produtos de reacção foram usados para transformar DH5a bactérias 13 e o ADN plasmídico a partir de colónias resistentes à canamicina foi sequenciado para assegurar a inserção da tau. Uma sequência validado shuttle-Tau vector foi depois utilizado para transferir o Tau ORF no vector pGLAP1, que fundia Tau em enquadramento com a etiqueta de LAP (EGFP-TEV-proteína-S), por incubação do vector vaivém-tau com o vector pGLAP1 e a recombinase que medeia a transferência do ORF a partir do vector vai-vem para pGLAP1. Os produtos de reacção foram utilizados para transformar as bactérias DH5aADN 13 e do plasmídeo a partir de colónias resistentes à ampicilina foi sequenciado para assegurar que a fusão LAP-tau estava na moldura. Sequência validado pGLAP1-LAP-tau foi, em seguida, co-transfectado com um vector que expressa a enzima flipase recombinação em células HEK293 que continha um único alvo reconhecimento flipase local (FRT) no seu genoma, que é o local de integração de genes com marcação de LAP 14. Esta linha celular expressa também o TetR que se liga aos operadores Tet a montante dos genes marcadas com LAP e silencia a sua expressão na ausência de Tet / Dox. integrantes estáveis ​​foram seleccionados com -Tet meio DMEM / F12 com 100 ug / ml de higromicina durante 5 dias. Higromicina focos de células resistentes individuais foram colhidas por adição de 20 ul de tripsina na parte superior e pipetando para cima e para baixo 2 vezes. As células foram colocadas numa placa de 24 poços e expandidas por crescimento contínuo em -Tet meio DMEM / F12. Para verificar que a célula resistente à higromicinas foram capazes de expressar LAP-Tau, células HEK293 LAP-tau foram induzidas com 0,1 ug / ml Dox durante 15 hr e extractos proteicos foram preparados a partir de células não induzidas e induzidas por Dox. Estes extractos foram separadas por SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de PVDF, e imunotransferidas para GFP e tubulina como controlo de carga. Como observado na Figura 4A, LAP-tau (visualizado com anticorpos anti-GFP) foi apenas expresso na presença de Dox. Para validar que LAP-tau foi correctamente localizada no fuso de microtúbulos mitótico durante a mitose, como tinha sido anteriormente demonstrado para a tau endógena 18, células HEK293 LAP-tau foram induzidas com 0,1 ug / ml Dox durante 15 horas e as células foram fixadas com 4% paraformaldeído e co-coradas para ADN (Hoechst 33342) e os microtúbulos (anticorpos anti-tubulina). Consistentemente, LAP-tau foi localizada para o fuso mitótico durante a metafase da mitose (Figura 4B). Para verificar que LAP-Tau e suas proteínas que interagem pode ser purificado com este sysTem, células HEK293 LAP-tau foram cultivadas em frascos rolantes para ~ 70% de confluência, induzida com 0,1 jig / ml Dox durante 15 horas, colhidas por agitação, lisadas com tampão de LAP300, e LAP-tau foi purificado utilizando o protocolo anterior. Os eluatos a partir de purificação do LAP-tau foram resolvidas por SDS-PAGE e o gel foi corado com prata. A Figura 4C mostra a purificação LAP-Tau, marcado com um asterisco é LAP-Tau e várias outras bandas de proteínas que interagem indicativo Tau pode ser visto. Figura 1: Visão geral da Geração de induzíveis linhas celulares estáveis marcado-colo por qualquer proteína de interesse. A grelha de leitura aberta (ORF) de genes de interesse são amplificados com os locais attB1 e attB2 flanqueamento 5 'e 3' as sequências finais, respectivamente (as sequências de iniciadores são dadas em A Tabela 1) e clonadas em o vector de transporte. Sequência é verificada vectores de vaivém com o gene de interesse são depois utilizado para transferir o gene de interesse no vector pGLAP1. A sequência verificada pGLAP1 vector com o gene de interesse é, em seguida, co-transfectado com o vector contendo a recombinase flipase para a linha celular desejada que contém um alvo único reconhecimento flipase local (FRT) no seu genoma, que é o sítio de integração do sistema LAP genes tagged. Estas linhas de células expressam também o repressor Tet (TetR) que se liga aos operadores Tet (TetO 2) a montante dos genes marcadas com LAP e silencia a sua expressão na ausência de Tet / Dox. O gene marcado-LAP de interesse é então recombinada no local DRF e integrantes estáveis ​​são seleccionadas com higromicina. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 2 "src =" / files / ftp_upload / 54870 / 54870fig2.jpg "/> Figura 2: Visão geral dos pedidos de linhas celulares estáveis com etiquetas voltas. As linhas celulares estáveis ​​indutíveis marcaram-PLA são induzidas para expressar a proteína LAP-marcadas de interesse por adição de Dox e podem ser sincronizados em várias fases do ciclo de célula ou pode ser estimulada com produtos químicos ou ligandos para activar qualquer via de sinalização desejado. A localização subcelular da proteína LAP-marcadas de interesse pode ser analisado por células vivas ou células de imagem fixa. proteínas marcadas com LAP também pode ser purificado por afinidade em tandem e suas proteínas que interagem podem ser identificadas por espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida (LC-MS / MS). Finalmente, Cytoscape pode ser usado para gerar uma rede de interacção proteína-proteína a proteína de isco. Dox indica doxiciclina, IP indica immunoprecipitate, EGFP indica reforçada proteína verde fluorescente, Tev indica local de clivagem TEV protease, e S indica S-tag.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Visão geral do etiquetado-LAP expressão de proteínas, purificação e preparação para Espectrometria de Massa. O protocolo tem 9 passos: 1) crescimento e a indução da expressão da proteína LAP-tag, 2) da colheita das células e lise, 3) A preparação de lisados, 4) a ligação de lisados ​​de grânulos anti-GFP, 5) clivagem de protease de TEV de o GFP-marcador, 6) a ligação de grânulos lisados ​​a proteína-S, 7) a eluição da proteína de isco e proteínas que interagem, e 8-9), a preparação de amostras para análises de proteómica à base de espectrometria de massa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. </p> Figura 4: Verificação de expressão LAP-Tau. (A) Western Blot (WB) análise de amostras de proteína a partir de células não induzidas e Dox induzida LAP-Tau HEK293 sondados com anti-GFP e os anticorpos anti-tubulina de detectar a proteína tau marcada com LAP e o controlo da Tubulina de carga, respectivamente. Note-se que LAP-tau é expresso apenas quando as células são induzidas com Dox. Células (B) que expressam mitóticos LAP-tau foram fixadas e co-coradas para ADN (Hoechst 33342) e tubulina (cuba) com anticorpos anti-tubulina e a localização subcelular de LAP-tau foi analisada por microscopia de fluorescência. Note-se que LAP-Tau localiza aos pólos do fuso e do fuso mitótico durante a mitose. (C) corado com prata do gel da purificação LAP-tau. MW indica o peso molecular, CL indica lisados ​​límpidos e E indicates eluatos finais. As amostras foram corridas em 4-20% SDS-PAGE e o gel foi corado com prata para visualizar as proteínas purificadas. Note-se que uma banda correspondendo a LAP-Tau está marcado com um asterisco e várias outras bandas correspondentes às proteínas co-purificação pode ser visto. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Fusão N-terminal para a frente 5'-GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG – (> 18gsn) -3 ' Reverso 5'-T GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT TTATCA – (> 18gsn) -3 ' Fusão C-terminal para a frente 5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC – (> 18gsn) -3 ' Reverso 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT L – (> 18gsn) -3 ' Tabela 1: Avanço e retrocesso Primers para amplificar ORF ou interesse para inserção no vector de transporte. Os locais attB são destacadas em negrito, GSN indica que os nucleótidos específicos mais de 18 genes são adicionados ao iniciador. Passo Temperatura Tempo A desnaturação inicial 94 ° C 2 min Ciclos de PCR de amplificação (35) Desnaturar 94 ° C 30 seg recozer 55 ° C (dependendo o primer Tm) 30 seg Ampliar 72 ° C 1 min / KB Aguarde 4 ° C indefinidamente Tabela 2: As condições de PCR para amplificação das ORFs de interesse. Vetor Adiante Sequencing Primer Reverter Sequencing Primer Vector shuttle 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ' Tabela 3: frente e reverso Sequencing Primers para o vector de transporte. identidade Estrutura Parental Promotor Bac Res Mam Res Tet reg? pGLAP1 péptido N-terminal de EGFP-TEV-S pcDNA5 / FRT / TO CMV amp Hyg sim pGLAP2 peptídeo N prazo Bandeira-TEV-S pcDNA5 / FRT / TO CMV amp Hyg sim pGLAP3 N-EGFP termo péptido-TEV-S; C prazo V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a amp Hyg Não pGLAP4 N prazo peptídeo Bandeira-TEV-S; ; C prazo V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a <td> Amp Hyg Não pGLAP5 S C-termo péptido-PreProt X2-EGFP pEF5 / FRT-V5 EF1a amp Hyg Não Tabela 4: Lista de vetores LAP / TAP disponíveis com os promotores variáveis, epitopo de marcas e capacidades de expressão Dox induzíveis para N ou Tagging Proteína C-terminal. Os vectores estão comercialmente disponíveis. Bac Res indica marcador de resistência bacteriana, Mam Res indica marcador de resistência de células de mamíferos, Tet reg? indica se a expressão é Tet / Dox regulável. Vetor Adiante Sequencing Primer Reverter Sequencing Primer pGLAP1 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 ' 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' pGLAP2 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 ' 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' pGLAP3 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 ' 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' pGLAP4 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 ' 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' pGLAP5 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 ' 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 ' Tabela 5: Avanço e retrocesso Sequencing Primers para pGLAP vetores.

Discussion

O protocolo delineado descreve a clonagem de genes de interesse no vector de codificação de LAP, a geração de linhas celulares estáveis ​​marcado com LAP indutíveis, e a purificação de complexos de proteínas marcadas com LAP para análises proteomic. Com relação a outras abordagens LAP / TAP-tagging, este protocolo foi simplificada para ser compatível com as abordagens de alto rendimento para mapear localização de proteínas e proteína-proteína interações dentro de qualquer via celular. Esta abordagem tem sido amplamente aplicada para a caracterização funcional de proteínas críticas para a progressão do ciclo celular, a formação do fuso mitótico, homeostase polares de fusos, e ciliogênese para citar alguns e tem ajudado a compreensão de como a desregulação destas proteínas pode levar a doenças humanas 15, 16,19,20. Por exemplo, o nosso grupo recentemente utilizado este sistema para definir a função e regulação da cinesina STARD9 mitótico (um alvo câncer candidato) na montagem do fuso 15,21, para definir umnova ligação molecular entre a cadeia Tctex1d2 dineína luz e síndromes costela polydactyly curtas (SRP) 19, e definir uma nova ligação molecular para entender como mutação da ubiquitina ligase Mid2 pode levar a deficiências intelectuais ligadas ao X 16. Outros laboratórios também aplicado com sucesso este método, incluindo um que determinou que Tctn1, um regulador de rato de sinalização Hedgehog, foi uma parte de um complexo de proteína associada a membrana que a composição ciliopathy ciliar regulamentado e ciliogênese de uma maneira dependente do tecido 22,23. Portanto, este protocolo pode ser amplamente aplicada à dissecção de qualquer via celular.

Um passo crítico neste protocolo é a seleção de linhagens de células estáveis ​​marcado-LAP que são resistentes a higromicina. Deve ser tomado cuidado especial para assegurar que todas as células na placa de controlo são mortos antes de seleccionar focos na placa experimental para amplificação. Higromicina também pode ser added durante a cultura de células de rotina de linhas celulares estáveis ​​marcado-LAP, garantir que todas as células manter o gene marcado-LAP de interesse no local FRT. Que advertem que nem todas as proteínas marcadas no LAP irá ser funcional e que é importante a ter lugar em ensaios que podem ser utilizados para testar a função da proteína. Exemplos de ensaios utilizados para testar a função de proteínas incluem o resgate de fenótipos induzida pelo siRNA e em ensaios de actividade in vitro. Para resolver quaisquer problemas potenciais com a adição de um grande LAP-tag, geramos anteriormente vetores TAP-tag compatíveis com este sistema, que contêm marcas menores, como FLAG, que são menos propensos a inibir a função e localização da proteína de interesse 4. Além disso, não existem vectores de codificação de LAP para gerar proteínas marcadas no LAP C-terminal ou proteínas marcadas com TAP C-terminais que são compatíveis com este sistema, que pode ser usado nos casos em que um LAP / etiqueta TAP não é tolerado no N -terminus de uma proteína. Além disso, The concentrações de sal e de detergente dos buffers de purificação (LAPX N) pode ser modificado para aumentar ou diminuir a severidade de purificação se não se observar nenhuma ou muito muitos interacções. Da mesma forma, o processo de purificação de afinidade em tandem é mais rigoroso do que os processos de purificação e interactianos fracos única pode ser perdido, assim, um único esquema de purificação pode ser usado quando poucos ou nenhum interagentes são identificados.

É importante notar que existem outras abordagens GFP epitopo de marcação que permitem que a proteína GFP grande escala marcação para localização de proteínas e de purificação estudos 24,25. Estes incluem a abordagem BAC TransgenOmics que utiliza cromossomos artificiais bacterianos para expressar genes GFP de interesse de seu ambiente nativo que contém todos os elementos de regulação, que imita expressão do gene endógeno 24. Mais recentemente, CAS9 / RNA-guiado (sgRNA) complexos de ribonucleoproteína (RNPs) têm sido utilizados para acabarogenously marcar os genes de interesse com um sistema split-GFP que permite a expressão de genes de GFP a partir de loci genómica endógena 25. Embora ambas as abordagens permitem a expressão de proteínas marcadas, sob condições endógenas, em comparação com o protocolo de LAP a etiquetagem aqui descrito, que não permitem expressão indutível e sintonizável dos genes marcadas de interesse. Além disso, eles têm ainda de ser aplicadas ao epitopo em tandem marcação para TAP. É também importante notar que outros sistemas de marcação também pode ser modificada para se tornar compatível com o sistema aqui descrito para gerar linhas celulares estáveis ​​marcadas no epitopo indutíveis. Por exemplo, a identificação biotina dependente de proximidade (BioID) tem atraído atenção considerável devido à sua capacidade para definir relações espaciais e temporais entre as proteínas que interagem 26. Esta técnica explora fusões de proteínas a uma estirpe promíscuo da Escherichia coli biotina ligase BirA, que biotinilaré qualquer proteína a cerca de 10 nm de raio da enzima ~. As proteínas biotiniladas são, em seguida, purificado por afinidade utilizando a captura de biotina-afinidade e analisadas quanto à composição por espectrometria de massa. BirA vai biotinilar qualquer proteína em estreita proximidade, mesmo transitoriamente, o que o torna especialmente adequado para a detecção de parceiros que interagem mais fracas dentro de um complexo 27. Além disso, o esquema de purificação não necessita que as interacções proteína-proteína endógenos permanecer intacto e pode ser levada a cabo sob condições de desnaturação, reduzindo assim a taxa de falsos positivos. Dentro do nosso protocolo de corrente, a substituição do vector pGLAP1 por um vector BirA etiquetagem pode transformar este sistema de identificação de interacções proteína-proteína com base na afinidade para os detectar com base na proximidade. Tal sistema seria altamente vantajosa para a detecção de interacções proteína transiente como é o caso, entre muitas interacções enzima-substrato e para mapear o inte proteína-proteína espaço-temporalractions dentro de estruturas definidas como tem sido realizadas para o centrossoma e cílios 26,28.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a National Science Foundation Grant NSF-MCB1243645 (JZT), any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the authors and do not necessarily reflect the views of the National Science Foundation. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Materials

Flp-In T-REx Core Kit Invitrogen K6500-01 Kit for generating cell lines that contain an FRT site and TrtR expression
PETG, 5X Nunc, Inc.  73520-734 Roller bottle for growing cells
PETG, 2.5X Nunc, Inc.  73520-420 Roller bottle for growing cells
Cell stackers Corning CellSTACK 3271 Cell stacker for growing cells
500 mL conical centrifuge tubes Corning  431123 Tubes for harvesting cells
Anti-GFP antibody Invitrogen A11122 Rabbit anti GFP antibody
Affiprep Protein A beads Biorad 156-0006 Used as a matrix for conjugating anti-GFP antibodies
Dimethylpimelimidate (DMP) ThermoFisher Scientific 21667 Used for conjugating anti-GFP antibodies to Protein A beads
TLA100.3 tubes Beckman 349622 Tubes for centrifuging protein lysates during the clearing step
TEV protease Invitrogen 12575-015 Used for cleaving the GFP tag off of N-terminal LAP-tagged proteins
Precession Protease GE Healthcare 27-0843-01 Used for cleaving the GFP tag off of C-terminal LAP-tagged proteins
S-protein agarose Novagen 69704 Used as a second affinity matrix during the purification of LAP-tagged protein complexes
QIAquick DNA gel extraction kit Qiagen 28704/28706 For use in purifying PCR products from an agarose gel
BP clonase II Invitrogen 11789020 Used for cloning ORF PCR products into the pDONR221 shuttle vector
LR clonase II Invitrogen 11791020 Used for cloning the ORF of the gene of interest into the pGLAP1 LAP-tagging vector
ccdB Survival 2 T1R E. coli Invitrogen A10460 Used for propgating shuttle vectors and pGLAP empty vectors
Fugene 6 Promega E2691 Transfection reagent for transfecting vectors into human cells
Tetracycline Invitrogen Q100-19 Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression 
Doxycycline Clontech 631311 Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression 
Hygromycin B Invitrogen 10687010 Drug for selecting stable LAP-tagged integrants
Kanamycin Corning 61-176-RG Drug for selecting Kanamycin resistant bacterial colonies
Ampicillin Fisher BP1760-5 Drug for selecting Ampicillin resistant bacterial colonies
4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels Biorad 4561094 Used for separating protein samples and final LAP-tag purification eluates
Silver Stain Plus Kit Biorad 1610449 Used for silver staining the eluates of LAP-tagged pufications and samples collected throughout the purification process 
Coomassie Blue stain Invitrogen LC6060 Used for staining SDS-PAGE gels to visulize LAP-tagged purifications and cutting out protein bands, mass spectrometry compatible
Shuttle vector pDONR221 Invitrogen 12536017 Shuttle vector for cloning the ORFs of genes of interest
Flippase expressing vector pOG44 Invitrogen V600520 Vector that expresses the Flippase recombinase for integrating LAP-tagged genes into the genome of FRT site containing cell lines
Platinum Taq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific 10966018 Used for PCR amplification of the ORFs of genes of interest
4X Laemmli sample buffer Biorad 1610747 Sample buffer for eluting purified LAP-tagged protein complexes from the bead matrix
Luria broth (LB) media Fisher BP9723-2 Used for growing DH5α bacteria
DNA miniprep kit Promega A1222 Used for making DNA plasmid minipreps
DMEM/F12 media Hyclone SH30023.01 For growing Hek293 human cells
FBS lacking Tet Altanta Biologicals S10350 Used for making -Tet DMEM/F12 media for generating and growing inducible LAP-tagged stable cell lines
Trypsin Hyclone SH30042.01 For lifting Hek293 cell foci from plates
Protease inhibitor tablets Roche 11836170001 Used for making protocol buffers, EDTA-free
10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol  Roche 11332473001 Used for making protocol buffers
PBS Corning 21-040-CM Used for making protocol buffers
Tween-20 Fisher BP337-500 Used for making protocol buffers
Sodium Borate Fisher S249-500 Used for making protocol buffers
Boric Acid Fisher A78-500 Used for making protocol buffers
Ethanolamine Calbiochem 34115 Used for making protocol buffers
NaCl Fisher P217-3 Used for making protocol buffers
KCl Fisher BP358-10 Used for making protocol buffers
Dithiothreitol (DTT) Fisher BP172-25 Used for making protocol buffers
MgCl2 Fisher M33-500 Used for making protocol buffers
Tris base Fisher BP152-5 Used for making protocol buffers
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References

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Inducible LAP-taggedStable Cell LinesProtein FunctionSpatiotemporal LocalizationProtein Interaction NetworksHEK293 CellsHygromycin SelectionTandem Affinity Purification (TAP)Tet/Dox InductionAnti-GFP AntibodyProtein A Beads

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Bradley, M., Ramirez, I., Cheung, K., Gholkar, A. A., Torres, J. Z. Inducible LAP-tagged Stable Cell Lines for Investigating Protein Function, Spatiotemporal Localization and Protein Interaction Networks. J. Vis. Exp. (118), e54870, doi:10.3791/54870 (2016).
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