JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

LAP-tagged מושרה שורות תאים יציבות על תפקוד החלבון חוקר, Spatiotemporal לוקליזציה רשתות אינטראקציה חלבון

Published: December 24, 2016
doi:
10.3791/54870
, , , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of California, Los Angeles, 2Molecular Biology Institute,University of California, Los Angeles, 3Jonsson Comprehensive Cancer Center,University of California, Los Angeles

Summary

We describe a method for generating localization and affinity purification (LAP)-tagged inducible stable cell lines for investigating protein function, spatiotemporal subcellular localization and protein-protein interaction networks.

Abstract

Multi-protein complexes, rather than single proteins acting in isolation, often govern molecular pathways regulating cellular homeostasis. Based on this principle, the purification of critical proteins required for the functioning of these pathways along with their native interacting partners has not only allowed the mapping of the protein constituents of these pathways, but has also provided a deeper understanding of how these proteins coordinate to regulate these pathways. Within this context, understanding a protein’s spatiotemporal localization and its protein-protein interaction network can aid in defining its role within a pathway, as well as how its misregulation may lead to disease pathogenesis. To address this need, several approaches for protein purification such as tandem affinity purification (TAP) and localization and affinity purification (LAP) have been designed and used successfully. Nevertheless, in order to apply these approaches to pathway-scale proteomic analyses, these strategies must be supplemented with modern technological developments in cloning and mammalian stable cell line generation. Here, we describe a method for generating LAP-tagged human inducible stable cell lines for investigating protein subcellular localization and protein-protein interaction networks. This approach has been successfully applied to the dissection of multiple cellular pathways including cell division and is compatible with high-throughput proteomic analyses.

Introduction

To investigate the cellular function of an uncharacterized protein it is important to determine its in vivo spatiotemporal subcellular localization and its interacting protein partners. Traditionally, single and tandem epitope tags fused to the N or C-terminus of a protein of interest have been used to facilitate protein localization and protein interaction studies. For example, the tandem affinity purification (TAP) technology has enabled the isolation of native protein complexes, even those that are in low abundance, in both yeast and mammalian cell lines1,2. The localization and affinity purification (LAP) technology, is a more recent development that modifies the TAP procedure to include a localization component through the introduction of the green fluorescent protein (GFP) as one of the epitope tags3. This approach has given researchers a deeper understanding of a protein’s subcellular localization in living cells while also retaining the ability to perform TAP complex purifications to map protein-protein interaction networks.

However, there are many issues associated with the use of TAP/LAP technologies that has hampered their widespread use in mammalian cells. For example, the length of time that is necessary to generate a stable cell line expressing a TAP/LAP tagged protein of interest; which typically relies on cloning the gene of interest into a viral vector and selecting single cell stable integrants with the desired expression level. Additionally, many cellular pathways are sensitive to constitutive protein overexpression (even at low levels) and can arrest cells or trigger cell death over time making the generation of a TAP/LAP stable cell line impossible. These and other constraints have impeded LAP/TAP methodologies from becoming high-throughput systems for protein localization and protein complex elucidation. Therefore, there has been considerable interest in the development of an inducible high-throughput LAP-tagging system for mammalian cells that takes advantage of current innovations in cloning and cell line technologies.

Here we present a protocol for generating stable cell lines with Doxycycline/Tetracycline (Dox/Tet) inducible LAP-tagged proteins of interest that applies advances in both cloning and mammalian cell line technologies. This approach streamlines the acquisition of data with regards to LAP-tagged protein subcellular localization, protein complex purification and identification of interacting proteins4. Although affinity proteomics utilizes a wide range of techniques for protein complex elucidation5, our approach is beneficial for expediting the identification of these complexes and their native interaction networks and is amenable to high-throughput protein tagging that is necessary to investigate complex biological pathways that contain a multitude of protein constituents. Key to this approach are advancements in cloning strategies that enable high fidelity and expedited cloning of target genes into an array of vectors for gene expression in vitro, in various organisms like bacteria and baculovirus, and in mammalian cells6,7. Additionally, the ORFeome collaboration has cloned thousands of sequence validated open reading frames in vectors that incorporate these advances in cloning, which are available to the scientific community8-11. In our system, the pGLAP1 LAP-tagging vector enables the simultaneous cloning of a large number of clones, which facilitates high-throughput LAP-tagging. This expedited cloning procedure is coupled to a streamlined approach for generating cell lines with LAP-tagged genes of interest inserted at a single pre-determined genomic locus. This makes use of cell lines that contain a single flippase recognition target (FRT) site within their genome, which is the site of integration for LAP-tagged genes. These cell lines also express the tetracycline repressor (TetR) that binds to Tet operators (TetO2) upstream of the LAP-tagged genes and silences their expression in the absence of Dox/Tet. This allows for Dox/Tet inducible expression of the LAP-tagged protein at any given time. Having the capability of inducible LAP-tagged protein expression is critical, since many cellular pathways are sensitive to the levels of critical proteins governing the pathway and can arrest cell growth or trigger cell death when these proteins are constitutively overexpressed, even at low levels, making the generation of non-inducible LAP-tagged stable cell lines impossible12.

Protocol

הערה: סקירה של דור שורות תאי יציבות מתויג LAP מושרים לכל חלבון העניין מתוארת באיור 1 ואת הסקירה של ביטוי חלבון מתויג LAP, טיהור והכנת proteomic המוני ניתוחית מתוארת באיור 3. 1. שיבוט את מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של הגן של עניין לתוך וקטור LAP-תג שיבוט ORF של הגן של עניין לתוך מעבורת וקטור. השתמש תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להגביר את ORF עניינים עם באתרי attB1 ו attB2 המתאים בתוך פריימרים היתוך או N-terminal או היתוך C-terminal. ראה טבלה מס '1 עבור רצפים פריימר ולוח 2 התנאים PCR. ג'ל לטהר את מוצרי ה- PCR על ידי לפתור אותן על ג'ל 1% agarose. ובלו הלהקה המוגבר כי הוא הגודל הרצוי לך מתוך הג'ל ולחלץ אותו מן פרוסת ג'ל באמצעות גרם DNAאל מיצוי ערכה לפי הוראות יצרן. דגירת attB המטוהרים המכיל מוצרי PCR עם attP המכיל וקטור הסעות ואת recombinase המאפשר מוצרי PCR כדי ולשלב מחדש לתוך הווקטור לפי הוראות יצרן (ראה טבלת M aterials). הערה: וקטורי הסעות ריקים וקטורי LAP תיוג המכילים את גן CCD B ו- צריכים להיות מופצות תאי חיידקיים עמידים B CCD (ראה לוח חומרים). עם זאת גן ccdB הוא recombined החוצה כאשר ORF מוכנס לתוך וקטורים אלה, ומכאן להשתמש בתאי DH5α E. coli רגילים כאשר הפצת וקטורים עם ORFs המשובט. Transform קולי תאים DH5α E. עם 1 μl של המוצר התגובה צלחת התאים טרנספורמציה על מרק לוריא (LB) צלחת אגר עם 50 מ"ג / מ"ל Kanamycin 13. בחר המושבות העמידות Kanamycin. לגדול מושבות שנבחרו ב LB ליdia עם 50 מ"ג / מ"ל Kanamycin, לעשות הכנה-מיני דנ"א לאשר שילוב הגן על ידי רצפי DNA באמצעות פריימרים רצף המפורטים בטבלה 3. העברת הגן של עניין ממעבורת וקטור לתוך וקטור LAP-תג. דגירה וקטור הסעות המכיל את הגן אומת רצף של ORF עניין עם וקטור LAP-תג (pGLAP1 היתוך N-terminal) ואת recombinase שמתווך העברת הגן של עניין מן וקטור הסעות לתוך וקטור LAP-תג לפי הוראות היצרן (ראה חומרים). הערה: סדרת LAP / וקטורים TAP שיכולים לשמש מבוסס על האמרגן הרצוי, epitope תג, ו- N או C- מסוף תיוג ניתן למצוא בטבלה 4. Transform קולי תאים DH5α E. עם 1 μl של המוצר התגובה צלחת התאים שינו לצלחת אגר LB עם 100 מ"ג / מ"ל אמפיצילין 13. בחר את קולו אמפיצילין העמידניז. לגדול מושבות שנבחרו בתקשורת LB עם 100 מ"ג / מ"ל אמפיצילין, לבצע אינטגרציה הגן DNA מיני-prep, ולאשר על ידי רצפי DNA באמצעות פריימרים רצף המפורטים בטבלה 5. דור 2. של שורת תאים יציבה ועין מתנהלת המבטא את ג'ין מתויג-LAP עניין בחר את שורת התאים המתאימה ביותר עבור הפרויקט של עניין. לחלופין, ליצור קו התא המארח מכל שורת תאים קיימים אשר constitutively מבטא את TetR ומכיל אתר FRT המאפשר הגן-tagged LAP עניין להיות משולבת ביציבות לתוך הגנום (ראה חומרים). הערה: פרוטוקול זה משתמש בקו התא HEK293 המכיל את TetR ואתר FRT, אשר גדל ב -Tet DMEM / F12 התקשורת [עשה עם 10% בסרום שור העובר (FBS) כי הוא נטול טטרציקלין (-Tet)] 4 . קבע את הריכוז המינימאלי של hygromycin נדרש להרוג את קו התא המארח בתוך 1 עד 2 קטןKS לאחר תוספת התרופה. הריכוז יכול להשתנות בין שורות תאים המארח, עם רוב הנע בין 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו 800 מיקרוגרם / מ"ל. הערה: HEK293 תאים שגודלו -Tet DMEM / F12 התקשורת עם 100 מיקרוגרם / מ"ל hygromycin ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ימותו תוך 1-2 שבועות. Co-transfect וקטור המבטא את recombinase flippase (מתווכת שילוב של הגן LAP-tagged עניין לתוך האתר FRT בתוך הגנום של התא) עם וקטור מתויג-LAP לתאים HEK293 באמצעות מגיב transfection לפי הוראות היצרן . השתמש יחס של 4: 1 של וקטור recombinase כדי LAP וקטור 14. הערה: היחס האופטימלי תלוי קו התא המארח ושיטת transfection, והן עשוי לחייב טיטרציה. יחס של 4: 1 עובד היטב עבור שורות התאים ביותר. כלול צלחת מעושה טרנספקציה כביקורת שלילית. יום אחד-transfection פוסט, להחליף את תקשורת -Tet DMEM / F12 עם תקשורת טריה. יומיים שלאחר transfectiעל, פיצול תאים כדי מפגש 25%. אפשר תאים ~ 5 שעות לצרף, אז להוסיף hygromycin המכיל תקשורת -Tet DMEM / F12 בריכוז הקבוע מראש בשלב 2.2. לקבלת HEK293 התאים משתמשים 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin. הערה: FRT המכיל שורת תאי HEK293 מכיל גם את TetR המשויך התנגדות Blasticidin, ולכן 5 מיקרוגרם / מיליליטר Blasticidin משמש במהלך תהליך בחירת תא קו היציב כדי לבחור עבור TetR ולמזער ביטוי דולף. חלף hygromycin המכיל תקשורת -Tet DMEM / F12 לפי צורך עד מוקדי תאים מובחנים להופיע דומות כתמים אטומים נגד הצלחת השקופה. הוסף 20 μl של טריפסין על גבי אחד מוקדי תאים ו pipet למעלה ולמטה 2 פעמים עם טיפ pipet 200 μl. המקום התאים בצלחת 24 היטב ולהרחיב את התאים על ידי נמשכה הצמיחה hygromycin המכילים -Tet DMEM / F12 התקשורת. מסך תאים עבור ביטוי חלבון LAP-tagged מושרה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי קבוע תאים או לחיות תאים ו / אומערבי סופג עבור תג GFP בתוך LAP-התג 15. 3. טיהור של קומפלקסי חלבונים-tagged LAP הערה: המלצות פרטי פרוטוקול טיהור חלבוני LAP-tagged הבאות על תנאים ומינון עבור טיהור חלבוני LAP-tagged טיפוסי המבוססת על ניסיון קודם. עם זאת, יש להיזהר כדי להבטיח אופטימיזציה אמפירית מתבצעת לכל רמת ביטוי חלבון מורכב חלבון של עניין לספק את התוצאות הטובות ביותר. צמיחת תאים וקציר Cell. הרחב את שורת תאים LAP-tagged תוקף לבידוד TAP של קומפלקסים חלבונים, על ידי HEK293 תאים passaging כל הרף לתוך צלחות גדולות ו / או בקבוקי רולר במדיה -Tet DMEM / F12 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. עבור שורות תאים מושרה ט / Dox, להשרות במשך 10-15 שעות בריכוז של 0.2 מיקרוגרם / מ"ל ​​ט / Dox כאשר התאים מגיעים ~ 70% confluency, לפני harvestinתאי ז. הערה: בפעם ריכוז אינדוקציה צריכה להיקבע עבור כל חלבון, טיטרציה של 0.1-1 מיקרוגרם / מיליליטר ט / Dox במשך 10-15 שעות מומלצת. קציר תאים על ידי תסיסה או תאי trypsinization ו גלול ב 875 XG למשך 5-10 דקות. זיווגים אנטי GFP נוגדנים חרוזים חלבון השתמש 40 מיקרוגרם של הנוגדן עבור immunoprecipitation מתוך lysate מוכן מן גלולה 0.5 מ"ל תא, נפח תא ארוז (PCV). הערה: כמות הנוגדנים הצורך יהיה תלוי שפע של חלבון LAP-tagged, בין היתר, ידרוש אופטימיזציה. טיטרציה של 10-40 מיקרוגרם מומלץ. לאזן 160 נפח ארוז μl (PV) חרוזים חלבון לתוך PBST (PBS + 0.1%-20 Tween) בצינור 1.5 מ"ל. לשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBST. הערה: כל השטיפות בזאת מבוצעות על ידי צנטריפוגה חרוז ב 5000 XG במשך 10 שניות. חרוזים Resuspend ב 500 PBST μl ולהוסיף 80 מיקרוגרם של זיקהארנב -purified נוגדן אנטי GFP על צינור אחד של 160 חרוזים μl. מערבבים במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר (RT). לשטוף חרוזים 2 פעמים עם 1 מ"ל של PBST. לאחר מכן, לשטוף חרוזים 2 פעמים עם 1 מ"ל של 0.2 M borate נתרן, pH 9 (20 מ"ל 0.2 M נתרן borate + 15 מ"ל 0.2 M חומצה בורית). לאחר שטיפה של דבר, להוסיף 900 ​​μl של borate 0.2 M נתרן, pH 9 להביא את הנפח הסופי ל 1 מ"ל. הוספת 100 μl של 220 מ"מ dimethylpimelimidate (DMP) לריכוז סופי של 20 מ"מ. סובב את הצינורות בעדינות ב RT במשך 30 דקות. עבור 220 מ"מ DMP, resuspend תכולת בקבוק אחד 50 מ"ג ב 877 μl של 0.2 M borate נתרן, pH 9 ולהוסיף מיד ההשעיה חרוז. לאחר הדגרה עם DMP, לשטוף חרוזים פעם 1 עם 1 מ"ל של 0.2 M ethanolamine, 0.2 M NaCl pH 8.5 כדי להשבית את crosslinker שיורית. חרוזים Resuspend ב 1 מ"ל של אותו חיץ ולסובב עבור שעה 1 ב RT. חרוזים גלולים וחרוזי resuspend ב 500 μl של 0.2 M ethanolamine, 0.2 M NaCl pH 8.5. חרוזים הם יציבים עבור several חודשים על 4 מעלות צלזיוס. הכנת החוצצים עבור תמוגה תא וטיהור Complex כן מאגרי LAPX (כאשר X הוא ריכוז המלח הרצוי [KCl מ"מ] של למאגר LAP; 300 מ"מ עבור תמוגה תא, 200 מ"מ לשטיפת החרוז ביותר, ו -100 מ"מ חרוזי כביסה לפני משחררי חלבונים) על ידי ביצוע פתרון pH 7.4 המכיל 50 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), KCl X מ"מ, 1 מ"מ חומצה tetraacetic אתילן גליקול (EGTA), 1 מ"מ MgCl 2, ו גליצרול 10%. הערה: הרכיבים של חיץ זה משמש להיות קרוב ככל האפשר בסביבה בתאים חיים. HEPES משמש חיץ זעם pH של 7.2-8.2. KCl הוא מלח משמש כדי לשמור על החוזק היוני של למאגר. EGTA הוא סוכן chelating שקושר יוני סידן כדי להפחית את רמות הסידן לעומת מגנזיום. גליצרול MgCl 2 משמשים כדי לשפר את היציבות של חלבונים. הכן חיץ LAPX N ידי הוספת 0.05% nonyl phenoxypolyethoxylethanol למאגר LAPX. הערה: phenoxypolyethoxylethanol nonyl הוא חומר ניקוי עדין כי solubilizes חלבונים, אלא משמר אינטראקציות בין חלבונים, ובכך ריכוז גבוה משמש בעת תהליך החילוץ והוא הוריד אז במהלך השלבים מחייבים כביסה. הכנת lysates תא Resuspend 500 μl של PCV לתוך 2.5 מ"ל של LAP300 עם 0.5 מ"מ dithiothreitol (DTT) ומעכבי פרוטאז. להוסיף 90 μl של 10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol (0.3% סופיים) ומערבב על ידי היפוך. מניחים על קרח למשך 10 דקות. צנטריפוגה ב 21,000 XG במשך 10 דקות. איסוף supernatant במהירות הנמוך זו (LSS). לקחת דגימה 10 μl של LSS לניתוח ג'ל. העבר LSS לצינור TLA100.3 ספין על 100,000 XG במשך שעה 1 ב 4 ° C. איסוף supernatant מהירות גבוהה זה (HSS), בתוך שפופרת ומניחים על קרח. לקחת דגימה 10 μl של HSS לניתוח ג'ל. הערה: יש להימנע לוקחת את שכבת השומנים העליונה ביותרד שכבת התאים פסולת ביותר בתחתית. שכבת השומנים יש להסיר על ידי השאיפה ואקום לפני איסוף HSS. לכידת זיקה ראשונה: כריכת חרוזים אנטי-GFP חרוזים טרום elute מצמידים נוגדנים (השתמש 160 μl של חרוזים לכל 0.5 מ"ל תא גלולה (PCV)) על ידי שטיפה אותם 3 פעמים עם 1 מ"ל של חיץ elution [3.5 M MgCl 2 עם 20 מ"מ טריס, pH 7.4] להיפטר זוגיים נוגדנים להפחית את הרקע. האם במהירות. אל תשאירו חרוזי מלח גבוה במשך זמן רב. לשטוף חרוזים 3 פעמים עם 1 מ"ל של LAP200 N. מערבבים HSS לחלץ עם חרוזים נוגדן עבור שעה 1 ב 4 ° C. צנטריפוגה ב 21,000 XG במשך 10 דקות. לקחת דגימה 10 μl של supernatant (כלומר, את הזרימה דרך (FT)) לניתוח ג'ל. לשטוף חרוזים 3 פעמים עם 1 מ"ל של LAP200 N עם 0.5 מ"מ מעכבי DTT ו פרוטאז. לשטוף חרוזים 2 פעמים (5 דקות כל אחד) עם 1 מ"ל של LAP200 N עם 0.5 מעכבי מ"מ DTT ו פרוטאז. שטפו במהירות 2 tIMEs עם 1 מ"ל של LAP200 N עם 0.5 מ"מ DTT ולא מעכבי פרוטאז לפני הוספת וירוס לחרוט טבק (TEV) פרוטאז. TEV מחשוף לדלל 10 מיקרוגרם פרוטאז TEV ב 1 מ"ל של LAP200 N ולסובב צינורות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערה: שלב זה יכול להיות מותאם לכל חלבון LAP-tagged להסתיים בעוד כמה שעות על ידי התאמת ריכוז של פרוטאז TEV, אשר יכול לסייע בשימור קומפלקסים חלבונים LAP-tagged. חרוזי ההעברה supernatant גלולים לצינור טרי. לשטוף חרוזים פעמיים עם 160 μl LAP200 N עם 0.5 מ"מ DTT ומעכבי פרוטאז (ריכוז משולש) כדי להסיר כל חלבון שיורית. לקחת דגימה 10 μl של supernatant לניתוח ג'ל. לכידת זיקה שנית: מלהתחבר לחלבון S Agarose לשטוף 1 שפופרת עם תערובת agarose חלבון 80 μl S (שרף ארוז 40 μl) 3 פעמים עם 1 מ"ל של LAP200 N. הערה: prot Sein מחייב את תג S יהיה לשקם RNase פעיל תג epitope השני אלטרנטיבה צריך להיחשב עבור קומפלקסים חלבונים המכילים RNA. להוסיף TEV eluted supernatant חרוזים agarose חלבון S ורוק עבור 3 שעות ב 4 ° C. חרוזים גלולה ולשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של LAP200 N עם 0.5 מ"מ DTT ו מעכבי פרוטאזות. לשטוף חרוזים 2 פעמים עם 1 מ"ל של LAP100. Elution חלבון Elute החלבונים את חלבון S agarose על ידי הוספת 50 μl של חיץ וחום מדגם 4x Laemmli ב 97 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הערה: חלבונים ניתן eluted גם מן החרוזים עם חיץ elution (3.5 M MgCl 2 עם 20 מ"מ טריס, pH 7.4). 4. זיהוי אינטראקציה חלבונים על ידי ניתוח ספקטרומטריית מסה בחן את האיכות של הטיהור על ידי ניתוח הדגימות שנאספו על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן (SDS-PAGE), צביעת כסף הג'ל (ראה <strong> חומרי טבלה) ועל ידי immunoblotting את eluates חיטוט עם נוגדנים אנטי GFP כדי להבטיח כי הטיהור מתויג LAP עבדה 16, ראה איור 4. כדי לזהות מינים לטיהור שיתוף stoichiometric ו substoichiometric, לקחת את דגימת elution הסופי ולהפריד אותו על ידי SDS-PAGE. כתם ג'ל עם כתם חלבון תואם ספקטרומטריית מסה. ובלו להקות הבולטים והחלל ביניהם מן הג'ל ולעבד אותם לניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה בנפרד 16. הערה: ישנן גישות רבות להפרדת eluates הטיהור הסופית והכין ספקטרומטריית מסה 5. לדוגמא, מתחמים-מטוהרי LAP ניתן eluted מן חרוזי S-חלבון באמצעות מלח גבוה (3.5 M MgCl 2) ואוכלוסיית החלבון השלמה בהמוניהם יכול להיות מנותחת על ידי ספקטרומטריית מסת 17. לחלופין, ניתן להפריד eluates הסופי 1 מ"מ על ידי SDS-PAGE ו להקה 1 מ"מ יחיד יכול להיות דוארxcised ונותח. זה מנקה את התערובת המורכבת של כל חרוזים או חומר חלקיקים כי יפריעו לניתוח.

Representative Results

כדי להדגיש את התועלת של מערכת זו, את מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של חלבון מחייב microtubule טאו שובט לתוך וקטור הסעות ידי הגברה ORF טאו עם פריימרים המכיל אתרים attB1 ו attB2 (טבלה 1) ו דוגרים המוצרים PCR עם וקטור הסעות וכן recombinase שמתווך החדרת המוצרים PCR לתוך וקטור הסעות. מוצרי התגובה שמשו להפוך חיידקי DH5α 13 ו- DNA פלסמיד ממושבות עמידות Kanamycin היה רצף כדי להבטיח חיבור טאו. וקטור תוקף רצף הסעות-טאו ששימש אז להעביר את ORF טאו לתוך וקטור pGLAP1, אשר התמזגו טאו ב מסגרת עם LAP (EGFP-TEV-S-חלבון) תג, על ידי דוגרים וקטור-טאו הסעות עם וקטור pGLAP1 ואת recombinase שמתווך העברת ORF מפני שיטת הסעות pGLAP1. מוצרי התגובה שמשו להפוך חיידקי DH5α13 ו- DNA פלסמיד ממושבות עמידות אמפיצילין היה רצף על מנת להבטיח כי היתוך LAP-טאו היה בתוך מסגרת. רצף תוקף pGLAP1-LAP-טאו היה שותף transfected אז עם וקטור המבטא את אנזים רקומבינציה flippase לתאי HEK293 שהכיל יעד הכרת flippase יחיד (FRT) באתר בתוך הגנום שלהם, המהווה את האתר של אינטגרציה עבור גני LAP-tagged 14. גם שורת תאים זו ביטאה את TetR הנקשרת מפעילי ט במעלה הזרם של גנים מתויג LAP ושתיקות הביטוי שלהם בהעדר ט / Dox. integrants יציבה נבחרו עם התקשורת -Tet DMEM / F12 עם 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin במשך 5 ימים. מוקדי תאים בודדים hygromycin עמיד נבצרו ידי הוספת 20 μl של טריפסין על גבי pipetting למעלה ולמטה 2 פעמים. תאים הונחו בצלחת 24 גם והורחבו נמשכה צמיחת תקשורת -Tet DMEM / F12. כדי לוודא תא hygromycin העמידהים היה מסוגל לבטא LAP-טאו, HEK293 תאי LAP-טאו היו מושרים עם 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר Dox במשך 15 תמציות hr וחלבון הוכנו מ הלא מושרה ואת מושרה Dox תאים. תמציות אלה הופרדו על ידי SDS-PAGE, הועבר קרום PVDF, ו immunoblotted עבור GFP ו טובולין כמו טעינה מלאה. כפי שניתן לראות באיור 4 א, LAP-טאו (דמיינו עם נוגדנים אנטי GFP) באה לידי ביטוי רק בנוכחות Dox. כדי לאמת כי LAP-טאו היה מקומי כראוי ציר microtubule mitotic במהלך מיטוזה, כפי שהוכיחו בעבר עבור טאו אנדוגני 18, HEK293 תאי LAP-טאו היו מושרים עם 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר Dox במשך 15 שעות ותאים תוקנו עם 4% paraformaldehyde ושיתוף מוכתם עבור DNA (Hoechst 33342) ו microtubules (נוגדנים נגד טובולין). באופן עקבי, LAP-טאו היה מקומי אל ציר mitotic במהלך metaphase של מיטוזה (איור 4B). כדי לוודא LAP-טאו וחלבוני האינטראקציה שלה יכול להיות מטוהר עם sys זהTEM, HEK293 תאים LAP-טאו גדלו בקבוקי רולר ל ~ 70% confluency, המושרה עם 0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​Dox במשך 15 שעות, שנקטפו על ידי תסיסה, lysed עם חיץ LAP300, ו LAP-טאו היה מטוהרים באמצעות פרוטוקול לעיל. Eluates מן טיהור LAP-טאו נפתרו על ידי SDS-PAGE ו הג'ל היה מוכתם כסף. איור 4C מראה את טיהור LAP-טאו, המסומנים בכוכבית היא LAP-טאו וכמה להקות אחרות מעידים על חלבוני אינטראקצית טאו ניתן לראות. איור 1: סקירה כללית של דור שורות תאים יציבות ועין מתנהלת-tagged LAP לכל חלבון עניין. מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של גנים של עניין הם מוגברים עם אתרי attB1 ו attB2 איגוף 5 'ו 3' הרצפים סוף, בהתאמה (רצפים פריימר ניתנים טבלה 1) ו משובטים לתוך וקטור ההסעות. וקטורי הסעות אומת רצף עם הגן של עניין משמשים לאחר מכן כדי להעביר את הגן של עניין לתוך וקטור pGLAP1. רצף אומת וקטור pGLAP1 עם הגן של עניין הוא אז שיתוף transfected עם הווקטור המכיל את recombinase flippase לתוך קו התא הרצוי המכיל יעד הכרת flippase יחיד (FRT) באתר בתוך הגנום שלהם, המהווה את האתר של אינטגרציה עבור LAP גני -tagged. שורות תאים אלה גם לבטא את מדכא ט (TetR) הנקשרת מפעילי ט (TETO 2) במעלה הזרם של גנים מתויג LAP ושתיקות הביטוי שלהם בהעדר ט / Dox. הגן-tagged LAP של ריבית recombined מכן לתוך אתר FRT ו integrants היציבה נבחרת עם hygromycin. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 2 "src =" / files / ftp_upload / 54,870 / 54870fig2.jpg "/> איור 2: סקירה של בקשות שורות תאים יציבות מתויג LAP. LAP-tagged שורות תאי יציבות מושרות הם המושרה להביע את חלבון LAP-tagged עניין ידי תוספת Dox ויכולות להיות מסונכרנות בשלבים שונים של מחזור התא או יכולות להיות מגורה עם כימיקלים או הליגנדים כדי להפעיל כל מסלול איתות רצויה. לוקליזציה subcellular של חלבון LAP-tagged עניין יכולה להיות מנותחת על ידי תא חי או הדמית תא קבועה. חלבונים-tagged LAP יכול גם להיות מטוהרים זיקה טנדם וחלבונים אינטראקציה שלהם ניתן לזהות על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS / MS). לבסוף, cytoscape יכול לשמש כדי ליצור רשת אינטראקציה בין חלבונים של חלבון הפיתיון. Dox מציין דוקסיציקלין, IP מציין immunoprecipitate, EGFP מציין משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק, Tev מציין אתר מחשוף פרוטאז TEV, ו- S מציין תג S.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3: מבט כולל של ביטוי חלבון LAP-tagged, טיהור והכנת ספקטרומטריית מסה. פרוטוקול יש 9 שלבים: 1) צמיחה אינדוקציה של ביטוי חלבון LAP-tagged, 2) קציר התא תמוגה, 3) הכנת lysates, 4) עקידת lysates חרוזים אנטי GFP, 5) מחשוף פרוטאז TEV של GFP-תג, 6) עקידת lysates חרוזים S-חלבון, 7) elution של חלבון הפיתיון וחלבונים אינטראקציה, ו 8-9) הכנת דגימות עבור ניתוחים proteomic מבוססי ספקטרומטריית מסה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. </p> איור 4: אימות ביטוי LAP-טאו. (א) כתם המערבי (WB) ניתוח של דגימות חלבון מן המושרה הלא המושרה ואת Dox LAP-טאו HEK293 תאים נחקר עם אנטי GFP ואנטי-טובולין נוגדנים לגילוי החלבון טאו-tagged LAP ואת טעינה מלאה טובולין, בהתאמה. שים לב LAP-טאו מתבטאת רק כאשר התאים הם המושרה עם Dox. (ב) בתאים mitotic להביע LAP-טאו קובעו שיתוף מוכתם עבור DNA (Hoechst 33342) ו טובולין (ג'קוזי) עם נוגדנים נגד טובולין ואת לוקליזציה subcellular של טאו LAP נותח על ידי microcopy הקרינה. שים לב LAP-טאו localizes לקטבים ציר ציר mitotic במהלך מיטוזה. (C) כסף מוכתם ג'ל של טיהור LAP-טאו. MW מציין משקל מולקולרי, CL מציין lysates פינה, ו- E הודיתeluates הסופי אטס. דוגמאות היו לרוץ על SDS-PAGE 4-20% ואת ג'ל הוכתם כסף לדמיין חלבונים מטוהרים. שים לב הלהקה המתאימה LAP-טאו מסומנת בכוכבית וכמה להקות אחרות המתאים חלבוני שיתוף לטיהור ניתן לראות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. היתוך N-terminal קָדִימָה 5'- GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG – (> 18gsn) -3 ' לַהֲפוֹך 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA – (> 18gsn) -3 ' היתוך C-terminal קָדִימָה 5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC – (> 18gsn) -3 ' לַהֲפוֹך 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G – (> 18gsn) -3 ' טבלה 1: קדימה לאחור תחל עבור הגברה ORFs או ריבית כדי להכניסו הסעות וקטור. אתרי attB מודגשים באותיות קידוש לבנות, GSN מציין כי יותר מ -18 נוקלאוטידים גנים ספציפיים מתווספים פריימר. שלב טֶמפֶּרָטוּרָה זְמַן denaturation הראשונית 94 ° C 2 דקות מחזורי הגברת PCR (35) לְפַגֵל 94 ° C 30 שניות לְחַשֵׁל 55 ° C (תלוי פריימר Tm) 30 שניות לְהַאֲרִיך 72 ° C 1 דקות / kb לְהַחזִיק 4 ° C ללא הגבלת זמן טבלה 2: PCR תנאי ההגברה של ORFs עניין. וֶקטוֹר פריימר רצף קדימה הפוך רצף פריימר וקטור הסעות 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 " 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 " טבלה 3: קדימה ההפוך הרצף Primers עבור שירות ההסעות של הווקטור. תְעוּדַת זֶהוּת מִבְנֶה שֶׁל הַהוֹרִים מְקַדֵם מיל Bac מיל אמא Reg ט? pGLAP1 N לטווח EGFP-TEV-S פפטיד pcDNA5 / FRT / TO CMV amp מוצרי היגיינה כן pGLAP2 N לטווח דגל-TEV-S פפטיד pcDNA5 / FRT / TO CMV amp מוצרי היגיינה כן pGLAP3 N לטווח EGFP-TEV-S פפטיד; C לטווח V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a amp מוצרי היגיינה לא pGLAP4 N לטווח דגל-TEV-S פפטיד; ; C לטווח V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a <td> Amp מוצרי היגיינה לא pGLAP5 C לטווח S פפטיד-PreProt x2-EGFP pEF5 / FRT-V5 EF1a amp מוצרי היגיינה לא לוח 4: רשימת וקטורי LAP / TAP זמינים עם יזמים משתנים, epitope-תגים, וכן יכול ביטוי Dox ועין מתנהל עבור N או תיוג חלבון-מסוף C. וקטורים זמינים מסחרית. מיל Bac מציין סמן עמיד חיידקים, מיל אמא מציינת סמן התנגדות תאים יונק, רג ט? הביטוי מציין אם הוא ט / Dox regulatable. וֶקטוֹר פריימר רצף קדימה הפוך רצף פריימר pGLAP1 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 " 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 " pGLAP2 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 " 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 " pGLAP3 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 " 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 " pGLAP4 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 " 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 " pGLAP5 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 " 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 " לוח 5: קדימה ההפוך הרצף Primers עבור וקטורי pGLAP.

Discussion

הפרוטוקול המתואר מתאר השיבוט של גני העניין לתוך וקטור תיוג LAP, הדור של שורות תאי יציבות מתויג LAP מושרים, והטיהור של קומפלקסי חלבונים-tagged LAP עבור ניתוחי proteomic. עם כל כבוד גישות LAP / TAP תיוג אחרים, פרוטוקול זה התייעל להיות תואם גישות תפוקה גבוהה למפה אינטראקציות לוקליזציה חלבון חלבונים בתוך כל נתיב תאי. גישה זו יושמה באופן נרחב על האפיון הפונקציונלי של חלבונים קריטיים עבור התקדמות מחזור התא, הרכבת ציר mitotic, הומאוסטזיס מוט ציר, ואת ciliogenesis שם כמה ו סייעה להבנה כיצד ויסות לא תקין של חלבונים אלה יכול להוביל למחל אדם 15, 16,19,20. לדוגמא, הקבוצה שלנו לאחרונה מנוצלת במערכת זו כדי להגדיר את הפונקציה והרגולציה של kinesin mitotic STARD9 (מטרת סרטן המועמד) ב הרכבת ציר 15,21, להגדירקישור מולקולרי חדש בין שרשרת אור dynein Tctex1d2 ותסמונות צלע לפולידקטיליות קצרות (SRPS) 19, ולהגדיר קישור מולקולרי חדש להבנה איך מוטציה של אנזים היוביקוויטין Mid2 יכולה להוביל צמודי X רוחניים מוגבלויות 16. מעבדות אחרות לא גם בהצלחה ליישם שיטה זו, כוללת אחד אשר קבעה כי Tctn1, רגולטור של איתות עכבר קיפוד, היה חלק ממכלול החלבון הקשורים ciliopathy כי בהרכב הממברנה ריסי מוסדר ciliogenesis באופן תלוי-רקמות 22,23. לכן, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם באופן נרחב דיסקציה של כל נתיב תאי.

שלב קריטי פרוטוקול זה הוא הבחירה של שורות תאים יציבות מתויג LAP כי הם hygromycin עמיד. זהירות מיוחדת יש לנקוט כדי להבטיח כי כל התאים בצלחת המלאה מתים לפני בחירת מוקדים בצלחת ניסיוני עבור הגברה. Hygromycin ניתן גם אדהד במהלך culturing תא השיגרתי של שורות תאי יציבות מתויג LAP כדי להבטיח עוד שכל התאים לשמור על הגן מתויג-LAP עניין באתר FRT. אנו מזהירים כי לא כל-tagged חלבונים LAP יהיה פונקציונלי וכי חשוב יש מבחני במקום שניתן להשתמש בהם כדי לבדוק את תפקוד החלבון. דוגמאות של מבחנים משמשים לבדיקת תפקוד חלבון כוללות הצלת פנוטיפים הנגרמת siRNA וב מבחני פעילות במבחנה. כדי לטפל בבעיות פוטנציאליות של התוספת של תג-LAP גדול, יש לנו שנוצרנו בעבר וקטורי TAP-תג תואמים עם מערכת זו המכילה תגים קטנים, כמו דגל, אשר נוטים פחות לעכב היטב את הפונקציה ולוקליזציה של החלבון של עניין 4. בנוסף, וקטורים התיוג LAP קיימים להפקת חלבונים-tagged LAP C- מסוף או C- מסוף-tagged חלבונים TAP התואמות מערכת זו, אשר ניתן להשתמש בהם במקרים בהם תג LAP / TAP אינו נסבל על N -terminus של חלבון. בנוסף, הריכוזי ה מלח וחומרי ניקוי מאגרי הטיהור (LAPX N) יכולים להיות שונים כדי להגדיל או להקטין את החמרת הטיהור אם אף אחד או יותר מדי אינטראקציות הם נצפו. באופן דומה, הליך טיהור זיקת טנדם הוא מחמיר יותר מאשר יחיד הליכי טיהור ו interactors החלש עלול ללכת לאיבוד, ולכן ערכת טיהור יחידה יכולה לשמש כאשר מעט או לא interactors מזוהה.

חשוב לציין כי גישות תיוג epitope GFP אחרות קיימות המאפשרים חלבון ה- GFP בקנה מידה גדולה תיוג ללימודי לוקליזציה חלבון וטיהור 24,25. אלה כוללים את הגישה BAC TransgenOmics אשר מנצל כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי לבטא גנים-tagged GFP עניין מהסביבה מולדתם המכיל את כל האלמנטים רגולטוריות, אשר מחקה ביטוי גנים אנדוגניים 24. לאחרונה, CAS9 / רנ"א חד-מודרך (sgRNA) מתחמי ribonucleoprotein (RNPs) שימשו לסייםogenously לתייג גנים של עניין עם מערכת מפוצלת GFP המאפשרת את הביטוי של גנים-tagged GFP מן הלוקוסים הגנומי אנדוגני שלהם 25. למרות ששתי הגישות הללו לאפשר את הביטוי של חלבונים המתויגים בתנאים אנדוגני, לעומת פרוטוקול LAP התיוג המתואר כאן, הם אינם מאפשרים ביטוי מושרה ו מתכונן מהגנים מתויגים עניין. בנוסף, הם עדיין צריכים להיות מיושמים epitope טנדם תיוג TAP. כמו כן, חשוב לציין כי מערכות תיוג אחרות יכולות גם להיות שונות כדי להיות תואם למערכת המתוארת כאן ליצירת שורות תאי יציבות מתויג epitope מושרים. לדוגמא, זיהוי ביוטין תלוי קרבה (BioID) צבר תשומת לב רבה בשל יכולתו להגדיר ביחסים במרחב ובזמן בין חלבוני אינטראקצית 26. טכניקה זו מנצלת בשילובי חלבון זן מופקר של האנזים ביוטין coli Escherichia הבירה, אשר biotinylateזה כל חלבון ברדיוס ~ 10 ננומטר של האנזים. החלבונים biotinylated אז הם זיקה מטוהרים באמצעות לכידת ביוטין אפיניות ניתוח מעבדתי של הרכב על ידי ספקטרומטריית מסה. בירה תהיה biotinylate חלבון כלשהו בסמיכות, אפילו זמנית, מה שהופך אותו מתאים במיוחד לאיתור שותפים באינטראקציה חלש בתוך 27 מורכבים. בנוסף, את ערכת הטיהור אינה מחייבת כי אינטראקציות חלבון-חלבון אנדוגני להישאר שלמות יכולות להתבצע בתנאי denaturing, ובכך להקטין את שיעור תוצאות חיוביות שגויות. בתוך הפרוטוקול הנוכחי שלנו, ההחלפה של וקטור pGLAP1 ידי וקטור בירת תיוג יכולה להפוך מערכת זו מזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון מבוסס על זיקת גילוי אותם על סמך הקרבה. מערכת כזו תהיה יתרון מאוד לאיתור אינטראקציות חלבון חולפות כפי שקורה בין אינטראקציות אנזים-מצע רבים למיפוי inte חלבוני spatiotemporalractions בתוך מבנים המוגדרים בוצע עבור centrosome ואת הריסים 26,28.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a National Science Foundation Grant NSF-MCB1243645 (JZT), any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the authors and do not necessarily reflect the views of the National Science Foundation. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Materials

Flp-In T-REx Core Kit Invitrogen K6500-01 Kit for generating cell lines that contain an FRT site and TrtR expression
PETG, 5X Nunc, Inc.  73520-734 Roller bottle for growing cells
PETG, 2.5X Nunc, Inc.  73520-420 Roller bottle for growing cells
Cell stackers Corning CellSTACK 3271 Cell stacker for growing cells
500 mL conical centrifuge tubes Corning  431123 Tubes for harvesting cells
Anti-GFP antibody Invitrogen A11122 Rabbit anti GFP antibody
Affiprep Protein A beads Biorad 156-0006 Used as a matrix for conjugating anti-GFP antibodies
Dimethylpimelimidate (DMP) ThermoFisher Scientific 21667 Used for conjugating anti-GFP antibodies to Protein A beads
TLA100.3 tubes Beckman 349622 Tubes for centrifuging protein lysates during the clearing step
TEV protease Invitrogen 12575-015 Used for cleaving the GFP tag off of N-terminal LAP-tagged proteins
Precession Protease GE Healthcare 27-0843-01 Used for cleaving the GFP tag off of C-terminal LAP-tagged proteins
S-protein agarose Novagen 69704 Used as a second affinity matrix during the purification of LAP-tagged protein complexes
QIAquick DNA gel extraction kit Qiagen 28704/28706 For use in purifying PCR products from an agarose gel
BP clonase II Invitrogen 11789020 Used for cloning ORF PCR products into the pDONR221 shuttle vector
LR clonase II Invitrogen 11791020 Used for cloning the ORF of the gene of interest into the pGLAP1 LAP-tagging vector
ccdB Survival 2 T1R E. coli Invitrogen A10460 Used for propgating shuttle vectors and pGLAP empty vectors
Fugene 6 Promega E2691 Transfection reagent for transfecting vectors into human cells
Tetracycline Invitrogen Q100-19 Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression 
Doxycycline Clontech 631311 Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression 
Hygromycin B Invitrogen 10687010 Drug for selecting stable LAP-tagged integrants
Kanamycin Corning 61-176-RG Drug for selecting Kanamycin resistant bacterial colonies
Ampicillin Fisher BP1760-5 Drug for selecting Ampicillin resistant bacterial colonies
4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels Biorad 4561094 Used for separating protein samples and final LAP-tag purification eluates
Silver Stain Plus Kit Biorad 1610449 Used for silver staining the eluates of LAP-tagged pufications and samples collected throughout the purification process 
Coomassie Blue stain Invitrogen LC6060 Used for staining SDS-PAGE gels to visulize LAP-tagged purifications and cutting out protein bands, mass spectrometry compatible
Shuttle vector pDONR221 Invitrogen 12536017 Shuttle vector for cloning the ORFs of genes of interest
Flippase expressing vector pOG44 Invitrogen V600520 Vector that expresses the Flippase recombinase for integrating LAP-tagged genes into the genome of FRT site containing cell lines
Platinum Taq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific 10966018 Used for PCR amplification of the ORFs of genes of interest
4X Laemmli sample buffer Biorad 1610747 Sample buffer for eluting purified LAP-tagged protein complexes from the bead matrix
Luria broth (LB) media Fisher BP9723-2 Used for growing DH5α bacteria
DNA miniprep kit Promega A1222 Used for making DNA plasmid minipreps
DMEM/F12 media Hyclone SH30023.01 For growing Hek293 human cells
FBS lacking Tet Altanta Biologicals S10350 Used for making -Tet DMEM/F12 media for generating and growing inducible LAP-tagged stable cell lines
Trypsin Hyclone SH30042.01 For lifting Hek293 cell foci from plates
Protease inhibitor tablets Roche 11836170001 Used for making protocol buffers, EDTA-free
10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol  Roche 11332473001 Used for making protocol buffers
PBS Corning 21-040-CM Used for making protocol buffers
Tween-20 Fisher BP337-500 Used for making protocol buffers
Sodium Borate Fisher S249-500 Used for making protocol buffers
Boric Acid Fisher A78-500 Used for making protocol buffers
Ethanolamine Calbiochem 34115 Used for making protocol buffers
NaCl Fisher P217-3 Used for making protocol buffers
KCl Fisher BP358-10 Used for making protocol buffers
Dithiothreitol (DTT) Fisher BP172-25 Used for making protocol buffers
MgCl2 Fisher M33-500 Used for making protocol buffers
Tris base Fisher BP152-5 Used for making protocol buffers
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  2. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  3. Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci STKE. , (2005).
  4. Torres, J. Z., Miller, J. J., Jackson, P. K. High-throughput generation of tagged stable cell lines for proteomic analysis. Proteomics. 9, 2888-2891 (2009).
  5. LaCava, J., et al. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: pointers, pitfalls, preferences and perspectives. Biotechniques. 58, 103-119 (2015).
  6. Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annu Rev Biochem. 58, 913-949 (1989).
  7. Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10, 1788-1795 (2000).
  8. ORFeome Collaboration. The ORFeome Collaboration: a genome-scale human ORF-clone resource. Nat Methods. 13, 191-192 (2016).
  9. Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. ORFeome cloning and systems biology: standardized mass production of the parts from the parts-list. Genome Res. 14, 2001-2009 (2004).
  10. Lamesch, P., et al. hORFeome v3.1: a resource of human open reading frames representing over 10,000 human genes. Genomics. 89, 307-315 (2007).
  11. Rual, J. F., et al. Human ORFeome version 1.1: a platform for reverse proteomics. Genome Res. 14, 2128-2135 (2004).
  12. Fiering, S., Kim, C. G., Epner, E. M., Groudine, M. An "in-out" strategy using gene targeting and FLP recombinase for the functional dissection of complex DNA regulatory elements: analysis of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8469-8473 (1993).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning : a laboratory manual. , (1989).
  14. Uyttersprot, N., Costagliola, S., Miot, F. A new tool for efficient transfection of dog and human thyrocytes in primary culture. Mol Cell Endocrinol. 142, 35-39 (1998).
  15. Senese, S., et al. A unique insertion in STARD9’s motor domain regulates its stability. Mol Biol Cell. 26, 440-452 (2015).
  16. Gholkar, A. A., et al. The X-Linked-Intellectual-Disability-Associated Ubiquitin Ligase Mid2 Interacts with Astrin and Regulates Astrin Levels to Promote Cell Division. Cell Rep. 14, 180-188 (2016).
  17. Graumann, J., et al. Applicability of tandem affinity purification MudPIT to pathway proteomics in yeast. Mol Cell Proteomics. 3, 226-237 (2004).
  18. Connolly, J. A., Kalnins, V. I., Cleveland, D. W., Kirschner, M. W. Immunoflourescent staining of cytoplasmic and spindle microtubules in mouse fibroblasts with antibody to tau protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, 2437-2440 (1977).
  19. Gholkar, A. A., et al. Tctex1d2 associates with short-rib polydactyly syndrome proteins and is required for ciliogenesis. Cell Cycle. 14, 1116-1125 (2015).
  20. Cheung, K., et al. Proteomic Analysis of the Mammalian Katanin Family of Microtubule-severing Enzymes Defines Katanin p80 subunit B-like 1 (KATNBL1) as a Regulator of Mammalian Katanin Microtubule-severing. Mol Cell Proteomics. 15, 1658-1669 (2016).
  21. Torres, J. Z., et al. The STARD9/Kif16a Kinesin Associates with Mitotic Microtubules and Regulates Spindle Pole Assembly. Cell. 147, 1309-1323 (2011).
  22. Garcia-Gonzalo, F. R., et al. A transition zone complex regulates mammalian ciliogenesis and ciliary membrane composition. Nat Genet. 43, 776-784 (2011).
  23. Chih, B., et al. A ciliopathy complex at the transition zone protects the cilia as a privileged membrane domain. Nat Cell Biol. 14, 61-72 (2012).
  24. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E3501-E3508 (2016).
  25. Poser, I., et al. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
  26. Firat-Karalar, E. N., Stearns, T. Probing mammalian centrosome structure using BioID proximity-dependent biotinylation. Methods Cell Biol. 129, 153-170 (2015).
  27. Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B. BioID: a screen for protein-protein interactions. Curr Protoc Protein Sci. 74, (2013).
  28. Gupta, G. D., et al. A Dynamic Protein Interaction Landscape of the Human Centrosome-Cilium Interface. Cell. 163, 1484-1499 (2015).

Tags

Inducible LAP-taggedStable Cell LinesProtein FunctionSpatiotemporal LocalizationProtein Interaction NetworksHEK293 CellsHygromycin SelectionTandem Affinity Purification (TAP)Tet/Dox InductionAnti-GFP AntibodyProtein A Beads

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bradley, M., Ramirez, I., Cheung, K., Gholkar, A. A., Torres, J. Z. Inducible LAP-tagged Stable Cell Lines for Investigating Protein Function, Spatiotemporal Localization and Protein Interaction Networks. J. Vis. Exp. (118), e54870, doi:10.3791/54870 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image