Inducibile LAP-tagged linee cellulari stabili per indagare la funzione delle proteine, Spatiotemporal Localizzazione e reti di interazione proteina

NOTA: Una panoramica della generazione di linee cellulari stabili LAP-tag inducibili per qualsiasi proteina di interesse è illustrato nella figura 1 e la panoramica di espressione proteica LAP-tag, purificazione e la preparazione proteomica massa analisi è illustrato nella figura 3. 1. Clonazione Open Reading Frame (ORF) del gene di interesse nel LAP-tag Vector Clonazione ORF del gene di interesse nel vettore navetta. Utilizzare reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare la ORF di interessi con gli opportuni siti attB1 e attB2 all'interno dei primer sia per fusione N-terminale o fusione C-terminale. Vedere la Tabella 1 per le sequenze primer e Tabella 2 per le condizioni di PCR. Gel purificare i prodotti di PCR per risolverli su un gel di agarosio 1%. Asportare la band amplificato che è la dimensione corretta dal gel ed estrarlo dalla fetta di gel utilizzando un DNA gkit di estrazione el secondo le istruzioni del produttore. Incubare la ATTB purificato contenente prodotti di PCR con un ATTP contenente vettore navetta e la ricombinasi che permette ai prodotti di PCR per ricombinare nel vettore secondo le istruzioni del produttore (vedi ento tabella). NOTA: vettori navetta vuoti e LAP-tagging vettori contengono il gene ccd B e devono essere propagato in cellule batteriche resistenti ccd B (vedi Materiali Tavolo). Tuttavia il gene CCDB viene ricombinato quando un ORF è inserito in questi vettori, quindi usare le cellule normali coli DH5α E. Quando moltiplicazione vettori con ORF clonati. Trasformare cellule di E. coli DH5α con 1 ml del prodotto di reazione e piastra le cellule trasformate su un brodo Luria (LB) piastra di agar con 50 mg / ml kanamicina 13. Selezionare le colonie resistenti kanamicina. Far crescere le colonie selezionate in LB media con 50 mg / ml kanamicina, fare una mini-prep DNA e confermare l'integrazione del gene per il sequenziamento del DNA utilizzando i primer di sequenziamento elencati nella tabella 3. Trasferimento del gene di interesse dal vettore Shuttle nel LAP-tag Vector. Incubare il vettore shuttle contenente la sequenza verificato gene di interesse ORF con il LAP-tag vettoriale (pGLAP1 per la fusione N-terminale) e la ricombinasi che media il trasferimento del gene di interesse dal vettore shuttle nel vettore LAP-tag secondo le istruzioni del produttore (vedi Materiali). NOTA: Una serie di vettori LAP / TAP che possono essere utilizzati in base promotore desiderato, epitopi-tag, e N o marcatura C-terminale possono essere trovati nella tabella 4. Trasformare cellule di E. coli DH5α con 1 ml del prodotto di reazione e piastra le cellule trasformate su una piastra di agar LB con 100 mg / ml ampicillina 13. Selezionare il colo resistente ampicillinaNies. Far crescere le colonie selezionate in LB media con 100 mg / ml ampicillina, fare un DNA mini-prep, e confermare l'integrazione del gene per il sequenziamento del DNA utilizzando i primer di sequenziamento elencati nella tabella 5. 2. Generazione di un inducibile Stabile linea cellulare che esprime il gene LAP-tag di interesse Selezionare la linea cellulare più adatto per il progetto di interesse. In alternativa, creare una linea di cellula ospite da qualsiasi linea cellulare esistente che esprime costitutivamente il TetR e contiene un sito FRT che permette il gene LAP-tag di interesse da stabilmente integrato nel genoma (vedi Materiali). NOTA: Questo protocollo utilizza una linea cellulare HEK293 che contiene il TetR e un sito FRT, coltivato in -Tet DMEM / F12 supporti [fornito con 10% di siero fetale bovino (FBS) che è privo di tetraciclina (-Tet)] 4 . Determinare la concentrazione minima di Hygromycin necessario per uccidere la linea di cellula ospite entro 1 a 2 Weeks dopo tossicodipendenza. La concentrazione può variare tra linee cellula ospite, con la maggior parte compresa tra 100 mg / ml e 800 mg / ml. NOTA: HEK293 cellule coltivate in -Tet DMEM media / F12 con 100 ug / ml Hygromycin a 37 ° C e 5% di CO 2 morirà entro 1-2 settimane. Co-trasfezione del vettore che esprime la ricombinasi flippase (media l'integrazione del gene LAP-tag di interesse nel sito FRT nel genoma della cellula) con il vettore LAP-tag in cellule HEK293 utilizzando un reagente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore . Utilizzare un rapporto di 4: 1 di ricombinasi vettore a vettore LAP 14. NOTA: Il rapporto ottimale dipende dalla linea cellulare ospite e metodo di trasfezione, e può richiedere una titolazione. Un rapporto di 4: 1 funziona bene per la maggior parte delle linee cellulari. Include una piastra di mock-transfettate come controllo negativo. Un giorno dopo la trasfezione, sostituire la media / F12 -Tet DMEM con mezzi freschi. Due giorni dopo transfectisu, celle divise al 25% di confluenza. Consentono alle cellule ~ 5 ore da allegare, quindi aggiungere Hygromycin contenenti media / F12 -Tet DMEM alla concentrazione prefissata in fase 2.2. Per HEK293 cellule usano 100 mg / ml Hygromycin. NOTA: La FRT contenente linea cellulare HEK293 contiene anche la TetR che è associato con la resistenza Blasticidin, quindi 5 mg / ml Blasticidin viene utilizzata durante il processo di selezione linea cellulare stabile selezionare per la TetR e per minimizzare l'espressione perde. Sostituire Hygromycin contenenti -Tet DMEM media / F12, se necessario fino a foci di cellule distinte sembrano che assomigliano macchie opache contro la lastra trasparente. Aggiungere 20 ml di tripsina in cima ad ogni foci di cellule e pipettare su e giù 2 volte con una punta di pipetta 200 microlitri. Cellule posto in un piatto ben 24 e ampliare le cellule di crescita continua in Hygromycin contenenti -Tet DMEM / F12 supporti. cellule dello schermo per l'espressione della proteina LAP-tag inducibile per cella fissa o live-cell microscopia a fluorescenza e / oWestern blotting per il tag GFP all'interno del LAP-tag 15. 3. La purificazione di complessi proteici LAP-tag Nota: Le seguenti lap-tag purificazione di proteine ​​dettagli del protocollo raccomandazioni sulle condizioni e volumi utilizzati per un tipico purificazione delle proteine ​​LAP-tag sulla base dell'esperienza precedente. Tuttavia, si deve prestare attenzione al fine di garantire che l'ottimizzazione empirica viene effettuata per ogni complesso di proteine ​​e proteine ​​livello di espressione di interesse per fornire i migliori risultati. Crescita delle cellule e Cell raccolta. Espandere la linea cellulare LAP-tag convalidato per l'isolamento TAP di complessi proteici, per passaging continuamente tutti HEK293 cellule in piatti più grandi e / o bottiglie a rulli in -Tet DMEM media / F12 a 37 ° C e 5% di CO 2. Per linee cellulari inducibili Tet / Dox, indurre il 10-15 ore ad una concentrazione di 0,2 mg / ml Tet / Dox quando le cellule raggiungono ~ 70% di confluenza, prima harvestincellule g. NOTA: Il tempo di concentrazione e di induzione deve essere determinata per ogni proteina, si raccomanda una titolazione di 0,1-1 mg / ml Tet / Dox per 10-15 ore. Celle di raccolta di agitazione o cellule tripsinizzazione e pellet a 875 xg per 5-10 min. Giunto anti-GFP anticorpi per Beads Proteina A Utilizzare 40 mg di anticorpo per immunoprecipitazione da un lisato preparato da un pellet di 0,5 ml di cellule, ematocrito (PCV). NOTA: La quantità di anticorpo necessaria dipenderà l'abbondanza della proteina LAP-tag, tra gli altri fattori, e richiederà ottimizzazione. Si raccomanda una titolazione di 10-40 mg. Equilibrare 160 microlitri di volume imballato (PV) Proteina A perline in PBST (PBS + 0,1% Tween-20) in una provetta da 1,5 ml. Lavare 3 volte con 1 ml di PBST. NOTA: Tutti i lavaggi nel presente documento sono effettuate mediante centrifugazione le perline a 5.000 xg per 10 sec. perline risospendere in 500 microlitri PBST e aggiungere 80 mg di affinità-purified coniglio anti-GFP anticorpi a ciascuna provetta di 160 perline microlitri. Mescolare per 1 ora a temperatura ambiente (RT). Lavare perline 2 volte con 1 ml di PBST. Poi, lavare perline 2 volte con 1 ml di 0,2 M sodio borato, pH 9 (+ 15 ml di 0,2 M di acido borico 20 ml di 0,2 M sodio borato). Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 900 ml di borato 0,2 M di sodio, pH 9 per portare il volume finale a 1 ml. Aggiungere 100 ml di 220 mM dimethylpimelimidate (DMP) ad una concentrazione finale di 20 mM. Ruotare delicatamente le provette a temperatura ambiente per 30 min. Per 220 mm DMP, risospendere contenuto di un flacone da 50 mg in 877 ml di 0,2 M borato di sodio, pH 9 e aggiungere immediatamente alla sospensione tallone. Dopo l'incubazione con DMP, lavare perline 1 volta con 1 ml di 0,2 M etanolammina, 0,2 M di NaCl pH 8,5 per inattivare il reticolante residua. perline risospendere in 1 ml dello stesso tampone e ruotare per 1 ora a temperatura ambiente. perline pellet e perline risospendere in 500 ml di 0,2 M etanolammina, 0,2 M di NaCl pH 8,5. Beads sono stabili per SeveraL mesi a 4 ° C. Preparazione del buffer per Cell Lysis e purificazione Complex Preparare buffer LAPX (dove X è la concentrazione di sale desiderato [mm KCl] del buffer LAP, 300 mm per la lisi cellulare, 200 mm per la maggior parte dei lavaggi di perline, e 100 mm per perle di lavaggio prima del rilascio di proteine), facendo un pH 7,4 soluzione contenente 50 mM 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES), X mM KCl, 1 mM di acido etilen glicole tetraacetico (EGTA), 1 mM MgCl 2 e 10% glicerolo. NOTA: I componenti di questo buffer vengono utilizzati per approssimare l'ambiente in cellule viventi. HEPES è usato come un buffer in rabbia pH di 7,2-8,2. KCl è un sale usato per mantenere la forza ionica del tampone. EGTA è un agente chelante che lega ioni calcio per ridurre i livelli di calcio rispetto al magnesio. Glicerolo e MgCl 2 sono utilizzati per migliorare la stabilità delle proteine. Preparare tampone LAPX N con l'aggiunta di 0,05% nonil phenoxypolyethoxylethanol al buffer LAPX. NOTA: Nonil phenoxypolyethoxylethanol è un detergente delicato che solubilizza le proteine, ma conserva le interazioni proteina-proteina, in tal modo una maggiore concentrazione viene utilizzato durante il processo di estrazione e viene quindi abbassata durante le fasi vincolanti e lavaggio. Preparazione di lisati cellulari Risospendere 500 ml di PCV in 2,5 ml di LAP300 con 0,5 mM ditiotreitolo (DTT) e inibitori della proteasi. Aggiungere 90 ml di 10% phenoxypolyethoxylethanol nonil (0,3% finale) e mescolare per inversione. Mettere in ghiaccio per 10 min. Centrifugare a 21.000 g per 10 min. Raccogliere questa surnatante bassa velocità (LSS). Prendere un campione di 10 ml del LSS per l'analisi del gel. Trasferimento LSS ad un tubo TLA100.3 e far girare a 100.000 xg per 1 ora a 4 ° C. Raccogliere il surnatante alta velocità (HSS), in un tubo e disporli sul ghiaccio. Prendere un campione di 10 ml di HSS per l'analisi del gel. NOTA: evitare di prendere la parte superiore di uno strato più lipidicod fondo più strato di detriti cellulari. Lo strato di lipidi deve essere rimosso mediante aspirazione a vuoto prima di raccogliere HSS. Prima Affinity Capture: Legatura di Beads anti-GFP Pre-Eluire anticorpi accoppiato perline (utilizzano 160 ml di perle per 0,5 ml di pellet cellulare (PCV)) lavando loro 3 volte con 1 ml di tampone di eluizione [3,5 M MgCl 2 con 20 mM Tris, pH 7.4] per sbarazzarsi di disaccoppiato anticorpi e riducono sfondo. Fare in fretta. Non lasciare perline in alto sale per un lungo periodo di tempo. Lavare perline 3 volte con 1 ml di LAP200 N. Mescolare HSS estrarre con perle di anticorpi per 1 ora a 4 ° C. Centrifugare a 21.000 g per 10 min. Prelevare 10 ml di surnatante (cioè, il flusso attraverso (FT)) per l'analisi del gel. Lavare perline 3 volte con 1 ml di LAP200 N con 0,5 mm DTT e inibitori della proteasi. Lavare perline 2 volte (5 minuti ciascuno) con 1 ml di LAP200 N con 0,5 mm DTT e inibitori della proteasi. Lavare rapidamente 2 tIME con 1 ml di LAP200 N con 0,5 mM DTT e senza inibitori della proteasi prima di aggiungere la proteasi del virus di incisione tabacco (TEV). TEV Decolleté Diluire 10 mg TEV proteasi in 1 ml di LAP200 N e ruotare provette a 4 ° C durante la notte. NOTA: Questo passaggio può essere ottimizzato per qualsiasi proteina LAP-tag per essere completato in poche ore, regolando la concentrazione di TEV proteasi, che può aiutare la conservazione di complessi proteici Lap-tag. perline pellet e il trasferimento surnatante in una nuova provetta. Risciacquare perle due volte con 160 ml LAP200 N con 0,5 mM DTT e inibitori della proteasi (concentrazione tripla) per eliminare ogni residuo di proteine. Prelevare 10 ml di surnatante per l'analisi del gel. Secondo Affinity Capture: Binding Protein a S Agarosio Lavare 1 tubetto di 80 microlitri proteina S agarosio liquami (40 ml di resina al sacco) per 3 volte con 1 ml di LAP200 N. NOTA: S protEin legame con la S-tag sarà ricostituire un RNasi attiva e un tag alternativa secondo epitopo dovrebbe essere preso in considerazione per RNA contenente complessi proteici. Aggiungere TEV eluita surnatante in perline di proteine ​​di agarosio e rock per 3 ore a 4 ° C. Perline pellet e lavare 3 volte con 1 ml di LAP200 N con 0,5 mm DTT e inibitori della proteasi. Lavare perline 2 volte con 1 ml di LAP100. Proteine ​​eluizione Eluire proteine ​​off proteina S agarosio aggiungendo 50 ml di tampone campione 4x Laemmli e scaldare a 97 ° C per 10 min. NOTA: Le proteine possono anche essere eluite dalle perline con tampone di eluizione (3.5 M MgCl 2 con 20 mM Tris, pH 7,4). 4. Identificare proteine ​​interagenti da Analysis Spettrometria di Massa Testare la qualità della purificazione analizzando i campioni raccolti mediante elettroforesi sodio dodecil solfato gel di poliacrilammide (SDS-PAGE), colorazione argentica gel (vedi <strong> Materiali Table) e mediante immunoblotting gli eluati e preciso con anticorpi anti-GFP per garantire che la purificazione LAP-tag lavorato 16, vedere Figura 4. Per identificare le specie di co-purificanti stechiometrico e substechiometrica, prelevare il campione di eluizione finale e separarlo da SDS-PAGE. Colorare il gel con una macchia proteina compatibile con la spettrometria di massa. Accise delle band più importanti e lo spazio tra di loro dal gel ed elaborarli per l'analisi mediante spettrometria di massa a parte 16. NOTA: Ci sono numerosi approcci per separare i eluati purificazione finale e li prepara per la spettrometria di massa 5. Ad esempio, i complessi LAP-purificati possono essere eluiti da perline S-proteina mediante salina (3,5 M MgCl 2) e l'intera popolazione proteine in massa possono essere analizzati mediante spettrometria di massa 17. In alternativa, eluati finali possono essere separate per 1 mm, tramite SDS-PAGE e un singolo nastro 1 mm può essere excised e analizzato. Questo cancella la miscela complessa di qualsiasi perline o particolato che interferiscono con l'analisi.