Induceerbare-LAP tag stabiele cellijnen voor het onderzoeken van eiwitfunctie, Spatiotemporal Localization en Protein Interaction Networks

OPMERKING: Een overzicht van de vorming van induceerbare-LAP hebben stabiele cellijnen voor een eiwit van interesse is in figuur 1 en het overzicht van LAP-gemerkt eiwit expressie, zuivering en bereiding voor de massa proteomische analyses wordt weergegeven in figuur 3. 1. Klonen van het open leeskader (ORF) van het gen van belang in het LAP-tag Vector Het kloneren van het ORF van het gen van belang in de shuttlevector. Met polymerasekettingreactie (PCR) om het ORF van belang te amplificeren met de juiste attB1 en attB2 plaatsen in de primers voor zowel N-terminale fusie of C-terminale fusie. Zie Tabel 1 voor de primersequenties en tabel 2 voor PCR omstandigheden. Gel zuiveren de PCR producten door oplossing ervan op een 1% agarose gel. Accijnzen de versterkte band, dat is de juiste maat uit de gel en pak het uit de gel slice met behulp van een DNA-gel extractie kit volgens instructies van de fabrikant. Incubeer de gezuiverde attB PCR producten bevatten een attP bevattende shuttle vector en het recombinase waarmee de PCR producten om te vermengen met de vector volgens de instructies van de fabrikant (zie M ateriaal tabel). LET OP: Lege shuttle vectoren en LAP-tagging vectoren bevatten de CCD B-gen en moeten worden gepropageerd in CCD B-resistente bacteriële cellen (zie Materials tabel). Maar de ccdB gen gerecombineerd wanneer een ORF in deze vectoren wordt geplaatst, dus gebruik maken van standaard DH5a E. coli-cellen bij het propageren van vectoren met gekloonde ORF. Transformeren van DH5a E. coli-cellen met 1 pi van het reactieproduct en de plaat de getransformeerde cellen op een Luria-bouillon (LB) agarplaat met 50 mg / ml kanamycine 13. Selecteer de kanamycine resistente kolonies. Groeien de geselecteerde kolonies in LB media met 50 mg / ml kanamycine, maak een mini-prep DNA en bevestig genintegratie door DNA sequentiebepaling via de sequencing primers in tabel 3 vermeld. Het overbrengen van het gen van belang uit de Shuttle Vector in het LAP-tag Vector. Incubeer de shuttle vector die de sequentie geverifieerd gen van belang ORF met de LAP-tag vector (pGLAP1 voor N-terminale fusie) en de recombinase dat de overdracht van het gen van interesse van de shuttle vector in het LAP-tag vector volgens medieert instructies van de fabrikant (zie Materials). OPMERKING: Een reeks LAP / TAP vectoren die kunnen worden gebruikt op basis van de gewenste promoter, epitoop-tag, en N of C-terminale tagging kan worden in tabel 4. Transformeren van DH5a E. coli-cellen met 1 pi van het reactieproduct en de plaat de getransformeerde cellen op een LB agar plaat met 100 mg / ml Ampicilline 13. Selecteer de Ampicilline resistente coloven. Groeien de geselecteerde kolonies in LB-medium met 100 mg / ml Ampicilline, maak een mini-prep DNA en bevestig genintegratie door DNA sequentiebepaling via de sequencing primers in Tabel 5 opgesomd. 2. Genereren van een induceerbare stabiele cellijn dat de LAP-tag gen van belang spreekt Selecteer de cellijn het best geschikt voor het project van belang zijn. Als alternatief, maak een gastheercel lijn van een bestaande cellijn die constitutief uitdrukt de TetR en bevat een FRT-plaats die het mogelijk maakt de LAP-tag gen van belang stabiel worden geïntegreerd in het genoom (zie Materials). Opmerking: In dit protocol wordt een HEK293 cellijn dat TetR en een FRT-plaats, dat gekweekt in -Tet DMEM / F12 media [gemaakt met 10% foetaal runderserum (FBS) dat zonder tetracycline (-Tet)] 4 bevat . Bepaal de minimumconcentratie van hygromycine vereist om de gastheercellijn binnen 1 tot 2 doden weeks na drugsverslaving. De concentratie kan variëren tussen gastheer cellijnen, met de meeste variërend tussen 100 ug / ml en 800 ug / ml. OPMERKING: HEK293 cellen die in -Tet DMEM / F12 medium met 100 ug / ml hygromycine bij 37 ° C en 5% CO 2 zal sterven binnen 1-2 weken. Co-transfecteren van de vector die uitdrukt de flippase recombinase (medieert de integratie van het LAP-gemerkte gen van belang in de FRT-plaats in het genoom van de cel) met het LAP tag vector in HEK293 cellen onder toepassing van een transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant . Met een verhouding van 4: 1 van recombinase vector LAP vector 14. OPMERKING: De optimale verhouding is afhankelijk van de gastheercellijn en wijze van transfectie, en kan een titratie vereist. Een verhouding van 4: 1 werkt goed voor de meeste cellijnen. Onder meer een mock-getransfecteerde plaat als een negatieve controle. Een dag na transfectie, vervang de -Tet DMEM / F12 media met verse media. Twee dagen na de transfectiop, split cellen tot 25% samenvloeiing. Laat cellen ~ 5 uur te bevestigen, voeg dan hygromycine-bevattende -Tet DMEM / F12 media bij een concentratie vooraf in stap 2.2. Voor HEK293 cellen gebruiken 100 ug / ml hygromycine. OPMERKING: De FRT met HEK293 cellijn bevat ook de TetR die wordt geassocieerd met resistentie Blasticidine derhalve 5 ug / ml blasticidine wordt gebruikt in de stabiele cellijn selectieproces selecteren voor het TetR en lekkende expressie minimaliseren. Vervang hygromycine-bevattende -Tet DMEM / F12 media als dat nodig is, totdat afzonderlijke cel foei erop dat ondoorzichtige vlekken tegen de transparante plaat lijken. Voeg 20 ul trypsine bovenop elke cel foci en pipet op en neer 2 maal met 200 pi pipet tip. Plaats cellen in een plaat met 24 putjes en de cellen door voortdurende groei van de hygromycine-bevattende -Tet DMEM / F12 media uit te breiden. Screen cellen voor induceerbare-LAP gelabeld eiwit expressie door vaste-cel of live-cell fluorescentie microscopie en / ofWestern blotting voor het GFP-tag in het LAP-tag 15. 3. Zuivering van LAP-tag eiwitcomplexen LET OP: De volgende LAP-gelabelde eiwit zuivering protocol gegevens aanbevelingen over de voorwaarden en volumes gebruikt voor een typische LAP-gelabelde eiwit zuivering op basis van eerdere ervaringen. Echter, moet voorzichtigheid worden betracht om ervoor te zorgen dat de empirische optimalisatie uit voor een eiwit complex en eiwit expressie niveau van de rente om de beste resultaten te leveren wordt uitgevoerd. Celgroei en Cell Oogst. Vouw de gevalideerde-LAP hebben cellijn TAP isolatie van eiwitcomplexen door continu passage alle HEK293 cellen tot grotere borden en / of rolflessen in -Tet DMEM / F12-medium bij 37 ° C en 5% CO2. Voor Tet / Dox induceerbare cellijnen te induceren gedurende 10-15 uur bij een concentratie van 0,2 ug / ml Tet / Dox wanneer de cellen bereikt ~ 70% confluentie voordat harvesting cellen. OPMERKING: als inductie tijd moet worden bepaald voor elk eiwit, wordt een titratie van 0,1-1 ug / ml Tet / Dox gedurende 10-15 uur aanbevolen. Oogst cellen door agitatie of behandeling met trypsine en pellet cellen op 875 xg gedurende 5-10 min. Koppeling anti-GFP antilichaam aan Proteïne A kralen Met 40 ug antilichaam voor immunoprecipitatie van een lysaat bereid uit een 0,5 ml celpellet, gepakte celvolume (PCV). OPMERKING: De hoeveelheid antilichaam die nodig is zal afhangen van de overvloed van het LAP-gelabeld eiwit, naast andere factoren, en optimalisatie vereisen. Een titratie van 10-40 ug aanbevolen. Equilibreren 160 ui gepakte volume (PV) Proteïne A kralen in PBST (PBS + 0,1% Tween-20) in een 1,5 ml buis. Was 3 maal met 1 ml PBST. LET OP: Alle wast hierin worden uitgevoerd door centrifugeren de kralen bij 5.000 g gedurende 10 seconden uitgevoerd. Resuspendeer kralen in 500 pi PBST en voeg 80 ug affiniteit-purified konijn anti-GFP antilichaam aan elke buis van 160 pi kralen. Meng gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT). Wassen kralen 2 maal met 1 ml PBST. Vervolgens wast kralen 2 maal met 1 ml 0,2 M natriumboraat, pH 9 (20 ml 0,2 M natriumboraat + 15 ml 0,2 M boorzuur). Na de laatste wasbeurt, voeg 900 ul van 0,2 M natriumboraat, pH 9 het uiteindelijke volume op 1 ml te brengen. Voeg 100 ul van 220 mM dimethylpimelimidate (DMP) tot een eindconcentratie van 20 mM. Draai de buizen voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 30 min. 220 mM DMP, resuspendeer inhoud van een 50 mg fles in 877 gl 0,2 M natriumboraat, pH 9 en voeg onmiddellijk de parelsuspensie. Na incubatie met DMP, wassen kralen 1 keer met 1 ml 0,2 M ethanolamine, 0,2 M NaCl pH 8,5 om de resterende verknopingsmiddel te inactiveren. Resuspendeer kralen in 1 ml van dezelfde buffer en draai gedurende 1 uur bij KT. Pellet kralen en resuspendeer kralen in 500 gl 0,2 M ethanolamine, 0,2 M NaCl pH 8,5. Kralen zijn stabiel several maanden bij 4 ° C. Bereiding van Buffers voor cellysis en zuivering Complex Bereid LAPX buffers (waarbij X de gewenste zoutconcentratie [mM KCl] van het LAP buffer; 300 mM voor cellysis, 200 mM meeste kralen wast, en 100 mM voor het wassen bolletjes vóór elueren proteïnen) door middel van een pH 7,4 oplossing bevattende 50 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), X mM KCl, 1 mM ethyleenglycol-azijnzuur (EGTA), 1 mM MgCl2 en 10% glycerol. OPMERKING: De componenten van deze buffer gebruikt om het milieu te benaderen in levende cellen. HEPES wordt gebruikt als een buffer in het pH woede van 7,2-8,2. KCl een zout gebruikt om de ionsterkte van de buffer te handhaven. EGTA is een chelaatvormer die calciumionen bindt aan de niveaus van calcium ten opzichte van magnesium verminderen. Glycerol en MgCl2 worden gebruikt om de stabiliteit van eiwitten te verbeteren. Bereid LAPX N buffer door het toevoegen van 0,05% nonyl phenoxypolyethoxylethanol de LAPX buffer. OPMERKING: Nonyl phenoxypolyethoxylethanol is een mild reinigingsmiddel dat eiwitten oplosbaar, maar handhaaft eiwit-eiwit interacties, waardoor een hogere concentratie wordt gebruikt tijdens het extractieproces en wordt dan verlaagd tijdens de binding en wasstappen. Bereiding van cellysaten Resuspendeer 500 pl PCV in 2,5 ml LAP300 met 0,5 mM dithiothreïtol (DTT) en proteaseremmers. Voeg 90 ul van 10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol (0,3% eind) en meng door omkeren. Plaats op ijs gedurende 10 min. Centrifugeer bij 21.000 xg gedurende 10 min. Verzamel deze lage snelheid supernatant (LSS). Neem een ​​10 ul monster van het LSS voor gel-analyse. Transfer LSS een TLA100.3 buis centrifugeren bij 100.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C. Verzamel deze hoge snelheid supernatant (HSS), in een buis en plaats op ijs. Neem een ​​10 ul monster van de HSS voor gel-analyse. LET OP: Vermijd het nemen van de top de meeste lipidelaag eend onderaan de meeste mobiele puin lagen. De lipidelaag worden verwijderd door afzuigen in vacuo voorafgaand aan het verzamelen van de HSS. Eerste Affiniteit Capture: Binding aan anti-GFP Beads Pre-elueren antilichaam gekoppelde korrels (gebruik 160 ul van kralen per 0,5 ml celpellet (PCV)) door ze te wassen 3 maal met 1 ml elutiebuffer [3,5 M MgCl2 met 20 mM Tris, pH 7,4] kwijt ontkoppeld antilichamen en verminderen achtergrond. Doe snel. Niet kralen in hoog zoutgehalte te verlaten voor een lange tijd. Was beads 3 maal met 1 ml LAP200 N. Mengen HSS extraheer met antilichaam kralen voor 1 uur bij 4 ° C. Centrifugeer bij 21.000 xg gedurende 10 min. Pipetteer 10 ul monster van de supernatant (dat wil zeggen de stroom door (FT)) voor gelanalyse. Was beads 3 maal met 1 ml N LAP200 met 0,5 mM DTT en proteaseremmers. Wassen kralen 2 maal (5 min elk) met 1 ml N LAP200 met 0,5 mM DTT en proteaseremmers. Was snel 2 times met 1 ml N LAP200 met 0,5 mM DTT en proteaseremmers geen voordat u de tabak etch virus (TEV) protease. TEV Splitsing Verdun 10 ug TEV protease in 1 ml N LAP200 en roteren buizen bij 4 ° C overnacht. Opmerking: Deze stap kan worden geoptimaliseerd voor LAP-gelabeld proteïne enkele uren te vullen door het aanpassen van de concentratie van TEV protease, die het behoud van LAP-gemerkt eiwit complexen kunnen helpen. Pellet kralen en overdracht supernatant naar een nieuwe buis. Spoel kralen tweemaal met 160 ul LAP200 N met 0,5 mM DTT en proteaseremmers (triple concentratie) om het resterende eiwit te verwijderen. Pipetteer 10 ul monster van de bovenstaande voor gelanalyse. Tweede Affiniteit Capture: Binding aan S Protein Agarose Was 1 tube 80 ul proteïne S agarose suspensie (40 pl gepakte hars) 3 maal met 1 ml LAP200 N. LET OP: S protein binding aan de S-tag zal een actieve RNase reconstitueren en een alternatief tweede epitooplabel moet worden overwogen voor RNA-bevattende eiwitcomplexen. TEV toevoegen geëlueerd supernatant S eiwit agarose korrels en Rock voor 3 uur bij 4 ° C. Pellet kralen en was 3 maal met 1 ml N LAP200 met 0,5 mM DTT en proteaseremmers. Wassen kralen 2 maal met 1 ml LAP100. eiwit Elutie Elueer eiwitten uit S proteïne-agarose door toevoeging van 50 ul van 4x Laemmli monsterbuffer en verwarm bij 97 ° C gedurende 10 minuten. OPMERKING: Eiwitten kunnen ook worden geëlueerd van de bolletjes met elutiebuffer (3,5 M MgCl2 met 20 mM Tris, pH 7,4). 4. Identificeer interacterende eiwitten door massaspectrometrie Analyse Test de kwaliteit van de zuivering door het analyseren van de verzamelde monsters van natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE), zilverkleuring de gel (zie <strong> Materialen Table) en door immunoblotting de eluaten en sonderen met anti-GFP antilichamen zodat de LAP hebben gewerkt zuivering 16, zie figuur 4. Stoechiometrische en substoichiometrische medezuiverende species identificeren, neemt de uiteindelijke elutie monster en gescheiden door SDS-PAGE. Vlekken op de gel met een massaspectrometrie compatibel eiwit vlek. Uitsnijden de duidelijke banden en de ruimte tussen de gel en verwerken voor analyse met massaspectrometrie afzonderlijk 16. LET OP: Er zijn tal van manieren voor het scheiden van de uiteindelijke zuivering eluaten en hen voor te bereiden massaspectrometrie 5. Zo kan LAP-gezuiverde complexen worden geëlueerd van S-eiwit korrels met hoog zoutgehalte (3,5 M MgCl2) en het gehele eiwitpopulatie massaal kunnen worden geanalyseerd door massaspectrometrie 17. Alternatief kan definitieve eluaten worden gescheiden door 1 mm SDS-PAGE en een 1 mm band kan excised en geanalyseerd. Dit wist het complex mengsel van korrels of deeltjes die interfereren met de analyse.