诱导LAP标记的稳定细胞系用于研究蛋白质功能，时空定位与蛋白质相互作用网络

注：可诱导的LAP标记的稳定细胞株为任何感兴趣的蛋白质的产生的概述在图1中被示出和LAP标记蛋白的表达，纯化和大规模蛋白质制剂的概要分析在图3中示出。 1.克隆兴趣的基因的开放阅读框（ORF）到LAP-标签矢量克隆兴趣的基因的ORF到穿梭载体。 使用聚合酶链反应（PCR），以扩增感兴趣的ORF用引物内的适当attB1和attB2位点对是N-端融合或C端融合。 见表1对PCR条件引物序列和表2中 。 凝胶通过解决这些问题，在1％琼脂糖凝胶纯化PCR产物。切除扩增带，它是从凝胶中的正确的大小和使用DNA得自凝胶切片提取它埃尔提取试剂盒根据制造商的说明。 孵育含有PCR产物与含有穿梭载体的attP位并允许PCR产物重组到载体中按照制造商的说明重组的纯化的attB位（参见主材料板表 ）。 注：空穿梭载体和LAP-标记载体包含的CCD B基因在CCD B抗性的细菌细胞中传播（见材料表 ）。然而CCDB基因重组出时的ORF插入这些载体中，从而用克隆的ORF传播矢量时使用标准的DH5α 大肠杆菌细胞。 转化DH5α 大肠杆菌细胞用1μl的反应产物和板转化细胞到的Luria肉汤（LB）琼脂平板上以50毫克/毫升卡那霉素的13。 选择卡那霉素抗性菌落。 生长在LB我所选择的菌落直径为50毫克/毫升卡那霉素，使的DNA小量制备和使用表3中列出的测序引物通过DNA测序确认基因整合。 从传送穿梭载体兴趣的基因导入LAP-标签矢量。 孵育含有感兴趣ORF的序列经过证明的基因与LAP-标签载体（pGLAP1对于N末端融合）和介导的目的基因的从穿梭载体转移入LAP-标签矢量按照所述重组穿梭载体制造商的说明（参见材料）。 注：一系列可根据所需的启动子，表位标签被用于LAP / TAP矢量，和N-或C-末端标记可以在表4中找到。 转化DH5α 大肠杆菌细胞用1μl的反应产物和板转化细胞上的LB琼脂板上，以100毫克/毫升氨苄青霉素13。 选择氨苄青霉素抗性结肠新兴工业化经济体。 生长在LB培养基将该选出的菌落用100毫克/毫升氨苄青霉素，使的DNA小量制备，并使用表5中所列的测序引物通过DNA测序确认基因整合。 2.生成诱导型稳定的细胞系，表达利益的LAP标记基因选择最适合于所关注的项目的细胞系。可替代地，创建从组成型表达的四面体和含有FRT位点，允许感兴趣的LAP标记基因被稳定地整合进基因组（参见材料）的任何现有的细胞系的宿主细胞系。 注意：此协议使用包含四面体和FRT位点，这是在-Tet的DMEM / F12培养基4 [用10％胎牛血清（FBS），该不含四环素（-Tet）制成]中生长的HEK293细胞系。 确定潮霉素的最小浓度必须在1个宿主细胞系杀死2凌晨药品加成后，KS。浓度可宿主细胞系之间变化，以100微克/毫升和800微克/毫升之间最测距。 注：在37℃和5％的CO 2将在1-2周内死亡在-Tet的DMEM / F12培养基中生长，100微克/毫升潮霉素HEK293细胞。 共转染表达所述翻转酶的重组酶使用转染试剂（介导的兴趣到细胞的基因组中的FRT位点的LAP标记基因的整合）与LAP标记载体导入HEK293细胞的载体按制造商的说明。使用的4比：重组酶载体的1至LAP矢量14。 注：最佳比例依赖于转染的宿主细胞系和方法，并可能需要一个滴定。 4：1的比例适用于大多数细胞系。包括一个模拟转板作为阴性对照。 有一天，转染后，用新鲜的介质替换-Tet DMEM / F12培养基。 两天后transfecti上分裂细胞25％汇合。允许细胞〜5小时附着，然后在2.2步一定的浓度添加含潮霉素-Tet DMEM / F12培养基。对HEK293细胞用100μg/ ml的潮霉素。 注：含有HEK293细胞系的FRT还包含与杀稻瘟抗性相关，因此在稳定细胞系的选择过程中使用5微克/毫升杀稻瘟选择用于四面体，并尽量减少渗漏表达的四面体。 更换含潮霉素-Tet DMEM / F12媒体直到需要不同的细胞灶出现类似于对透明板不透明的斑。 加入20微升胰蛋白酶对每一个细胞灶顶部和吸管上下2次用200μl枪头。位置细胞在24孔板并展开在含有潮霉素-Tet的DMEM / F12培养基的细胞不断生长。 屏幕细胞诱导LAP-标记的蛋白质表达固定细胞或活细胞荧光显微镜和/或Western印迹的LAP-标签15中的GFP标记。 3. LAP标记的蛋白复合物的分离纯化注：用于基于先前的经验的典型LAP标签蛋白纯化条件和卷下LAP标签蛋白纯化协议细节的建议。然而，应谨慎行事，以确保实验优化的利息蛋白复合物及蛋白表达水平，以提供最好的结果进行。 细胞生长和细胞收获。 扩大为蛋白质复合物的TAP隔离的验证LAP标记细胞系，由所有的HEK293细胞不断传代入-Tet的DMEM / F12介质更大的板和/或滚瓶在37℃和5％的CO 2。 对于四环素/阿霉素诱导的细胞系，诱导10-15小时在0.2微克/毫升四环素/ DOX当细胞达到〜70％汇合的浓度harvestin前G细胞。 注：浓度和诱导时间应确定每个蛋白质，建议0.1-1微克/毫升四环素/ DOX的10-15小时的滴定。 收获细胞通过搅拌或胰蛋白酶消化和沉淀的细胞以875 xg离心5-10分钟。 耦合抗GFP抗体蛋白A珠从0.5 ml细胞沉淀制备的裂解物中，红细胞压积（PCV）的使用抗体的40微克进行免疫沉淀。 注：将取决于大量的LAP-标记的蛋白质，以及其他因素的需要的抗体的量，并且将需要优化。推荐10-40微克的滴定。 平衡160微升填充体积（PV）的蛋白A珠成的PBST（PBS + 0.1％吐温20）在1.5ml管中。用1ml的PBST洗涤3次。 注意：本文中所有的洗涤液通过在5000 xg离心离心珠子，持续10秒进行。 珠悬浮在500微升PBST并加入80微克亲和力- 纯化的兔抗GFP抗体的160微升小珠每个管。混合，在室温下（RT）1小时。 用1ml的PBST洗涤珠2次。然后，洗涤​​珠子2次，用1ml的0.2M硼酸钠，pH值9（20毫升0.2M的硼酸钠+15毫升的0.2M硼酸）的。最后一次洗涤后，加入900微升硼酸0.2M的钠，pH为9，使最终体积至1ml。 加入100微升220毫dimethylpimelimidate（DMP）的为20毫米的最终浓度。轻轻旋转试管在室温30分钟。对于220毫米DMP，悬浮1个50毫克一瓶内容877微升0.2M的硼酸钠，pH值9，并立即加入到珠悬浮液。 与DMP温育后，洗涤珠子1次用1毫升的0.2M乙醇胺，0.2M NaCl的pH 8.5的灭活残留交联剂。在1ml的相同缓冲液重悬珠子旋转在RT 1小时。沉淀珠粒并在500微升的0.2M乙醇胺，0.2M NaCl的pH 8.5的悬浮珠粒。珠是Severa的稳定升个月在4℃。 缓冲区的细胞裂解复杂的纯化制备方法通过使pH为7.4的溶液;制备LAPX缓冲器（300毫对于细胞裂解，200mM的大多数珠粒洗涤，和100mM洗涤珠粒之前洗脱的蛋白质，其中X为所需的盐的浓度[毫米氯化钾]的LAP缓冲器的）含有50mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）中，X毫米氯化钾，1mM的乙二醇四乙酸（EGTA），1mM的MgCl 2的，和10％甘油。 注：此缓冲区的组件用于在活细胞来近似环境。 HEPES用作在7.2-8.2的pH值愤怒的缓冲器。氯化钾是用于维持缓冲液的离子强度的盐。 EGTA是结合的钙离子，以减少相比镁钙的水平螯合剂。甘油和MgCl 2的用于提高蛋白质的稳定性。 通过添加0.05％壬phenoxypol准备LAPX N缓冲yethoxylethanol到LAPX缓冲区。 注：壬phenoxypolyethoxylethanol是温和的洗涤剂增溶的蛋白质，但保留蛋白质 – 蛋白质相互作用，从而在提取过程中使用较高的浓度，然后将其在结合和洗涤步骤降低。 细胞裂解液的制备悬浮500微升PCV成2.5毫升LAP300的用0.5mM二硫苏糖醇（DTT）和蛋白酶抑制剂。加入90微升10％壬phenoxypolyethoxylethanol（0.3％最终），并通过倒置混合。 在冰上放置10分钟。离心在21000 XG 10分钟。收藏本低速上清液（LSS）。就拿LSS的凝胶分析10微升的样品。 在4℃LSS转移到TLA100.3管旋在100,000 XG 1小时。收藏本高速上清液（HSS），在管置于冰上。就拿HSS的凝胶分析10微升的样品。 注意：避免采取最上面的脂质层的D中的底部最细胞碎片层。脂质层应由之前收集所述HSS真空抽吸除去。 首先亲和捕获：绑定到抗GFP珠预洗脱抗体偶联的珠子（用160微升每0.5ml细胞沉淀（PCV）珠）由1毫升洗脱缓冲液[3.5米氯化镁 20毫米的Tris，pH值7.4的洗完3次摆脱解耦抗体和降低背景。快速完成。不要留在高盐珠子很长一段时间。 用1ml的LAP200Ñ洗涤珠粒3次。混合HSS与抗体珠提取1小时，在4℃。离心在21000 XG 10分钟。取上清的10微升样品（ 即通过（FT）的流量）进行凝胶分析。 用1ml的LAP200Ñ用0.5mM DTT和蛋白酶抑制剂洗珠子3次。用1ml的LAP200Ñ用0.5mM DTT和蛋白酶抑制剂的洗涤珠2次（每次5分钟）。快洗2吨输入法编辑器与用0.5mM DTT加入1ml LAP200 N和添加烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶之前没有蛋白酶抑制剂。 TEV切割稀释为10μgTEV蛋白酶在1ml LAP200 N和在4℃旋转管过夜。 注意：此步骤可以为任何LAP标记蛋白进行优化，以在几个小时内，通过调整TEV蛋白酶的浓度，这可以帮助LAP标记蛋白质复合物的保存完成。 粒料珠和转移上清液至新管。用160微升LAP200Ñ用0.5mM DTT和蛋白酶抑制剂（三重浓度）冲洗珠子两次，以除去任何残留的蛋白。取上清液进行凝胶分析的10微升样品。 二亲和捕获：绑定到的S蛋白琼脂糖洗80微升S蛋白琼脂糖浆液1管（40微升填充树脂）用1ml LAP200 N 3次。 注：•PROTEIN结合到S-标签将重组活性RNA酶和一个替代性的第二表位标签应考虑含RNA的蛋白质的复合物。 添加TEV在4℃洗脱上清液S蛋白琼脂糖珠岩3小时。沉淀小珠和洗涤3次用1毫升LAP200Ñ用0.5mM DTT和蛋白酶抑制剂。用1毫升LAP100洗珠2次。 蛋白质洗脱通过加入50μl4×Laemmli样品缓冲液和热的在97℃下进行10分钟的琼脂糖洗脱蛋白质关S蛋白。 注：蛋白质，也可以从用洗脱缓冲液（3.5米的MgCl 2用20mM Tris，pH 7.4）中的珠洗脱。 4.确定通过质谱分析相互作用的蛋白质通过分析通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），银染凝胶的收集的样品测试纯化的质量（见<strong>的材料表），并通过免疫印迹洗脱液并用抗GFP抗体探测，以确保LAP标记纯化工作16， 见图4。 以确定化学计量和亚化学计量的共同净化物种，采取最终洗脱样品并通过SDS-PAGE分离它。染色用质谱兼容蛋白染色的凝胶。切除最突出的带，并从凝胶中它们之间的空间并对其进行处理用于通过质谱法分别16分析。 注：有分离最终纯化洗脱液，并为他们准备质谱5无数的方法。例如，LAP-纯化络合物可以由S蛋白珠通过使用高盐（3.5米的MgCl 2）和整个蛋白群集体可以通过质谱法17进行分析洗脱。可替换地，最终洗脱物可以1毫米×SDS-PAGE和一个1 mm表带能电子被分离xcised和分析。这将清除的任何珠粒或颗粒物质，将干扰分析的复杂混合物。