Summary

El examen de la Asamblea proteasoma con recombinante arqueano Proteasomas y desnaturalizante PÁGINA: El Caso de un enfoque combinado

Published: December 17, 2016
doi:

Summary

Este protocolo utiliza tanto la co-expresión de subunidades y de mezcla para un examen más a fondo de ensamblaje proteasoma subunidad recombinante postlysis.

Abstract

Proteasomas se encuentran en todos los ámbitos de la vida. Ellos proporcionan la principal vía de degradación de proteínas intracelulares en las células eucariotas, aunque su montaje no se conoce completamente. Todos los proteasomas contienen una partícula estructuralmente conservadas núcleo (CP), o proteasoma 20S, que contiene dos anillos de subunidades beta heptameric emparedadas entre dos anillos α subunidad heptameric. Archaeal proteasomas 20S son de composición más simple en comparación con sus homólogos eucariotas, sin embargo, que ambos comparten un mecanismo de montaje común. En consecuencia, arqueas proteasomas 20S siguen siendo modelos importantes para el montaje del proteasoma eucariota. En concreto, la expresión recombinante de 20S arqueas proteasomas junto con electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante (PAGE) ha dado muchas pistas importantes sobre la biogénesis del proteasoma. A continuación, se discute un medio para mejorar la estrategia habitual de la co-expresión de α del proteasoma arqueas y las subunidades ß antes de nondenaturiPÁGINA ng. Se demuestra que a pesar de la rápida y eficiente, un enfoque coexpresión solo puede faltar montaje intermedios clave. En el caso de la proteasoma, la coexpresión no puede permitir la detección de la media-proteasoma, una que contiene una α-anillo completo intermedia y una β-anillo completo. Sin embargo, este intermedio se detecta fácilmente mediante la mezcla de lisado. Sugerimos que la combinación de co-expresión con mezcla lisado se obtiene un enfoque que es más profundo en el análisis de montaje, sin embargo, sigue siendo no intensiva de trabajo. Este enfoque puede ser útil para el estudio de otros complejos multiproteicos recombinantes.

Introduction

Complejos multiproteicos llevan a cabo numerosas actividades celulares críticas 1. Para muchos de estos complejos, se sabe mucho más acerca de su estructura y la función de aproximadamente el 2,3 de su montaje. El proteasoma es uno tan complejo y se encuentra en todos los ámbitos de la vida. En eucariotas, esta máquina molecular está en el núcleo del sistema de proteasoma / ubiquitina (UPS) y proporciona la principal vía de degradación de proteínas intracelulares 4. El proteasoma eucariota (referido como el proteasoma 26S) se compone de dos conjuntos principales sub: un proteasoma 20S, o núcleo de la partícula (CP) 5, que puede ser un tope en uno o ambos extremos por una partícula de regulación de 19S (RP) 6.

El proteasoma 20S es un gran proteasa compartimentada. Su estructura cuaternaria se conserva absolutamente en todos los dominios de la vida y consiste en una pila de cuatro ciclos de siete miembros que contienen dos tipos de subunidades relacionadas estructuralmente, α; y ß 5,7,8. En eucariotas, los dos anillos exteriores están cada uno compuesto de siete subunidades alfa diferentes y los dos anillos interiores están cada uno compuesto de siete subunidades beta distintas; actividad proteolítica reside dentro de tres de las subunidades beta. Por el contrario, los anillos Cp de arqueas y bacterias normalmente se componen de un solo tipo de α y un tipo de subunidad β. Proteasomas arqueas han proporcionado un importante sistema modelo para estudiar el montaje del proteasoma tanto por su simplicidad compositiva y su compartir un mecanismo de ensamblaje común con sus homólogos eucariotas 9-13. En breve, las subunidades alfa ensamblan en anillos alfa primero, que sirven como un andamio sobre el que beta subunidades de montar. Las medias proteasomas resultantes (α 7 β 7) dimerize, dando lugar a ensamblados completamente CP (α β 7 7 7 β α 7). Durante la dimerización, los propéptidos presentan en subunidades ßse eliminan autocatalítica, la exposición de las treoninas N-terminales catalíticos. El uso de proteasomas arqueas para modelar ensamblaje tiene con frecuencia las ventajas de la producción de proteínas recombinantes del proteasoma archaea en Escherichia coli. Este es un enfoque valioso porque permite a las subunidades que se producen en diversas combinaciones, ya que ambos WT y versiones mutantes, en un organismo huésped que no produce sus propios proteasomas.

El control de la asamblea de varios complejos de proteínas bioquímicamente requiere algún tipo de método de fraccionamiento que separa los complejos totalmente ensamblados de montaje intermedios y precursores. Debido a su capacidad de resolver superior, no desnaturalizante de poliacrilamida electroforesis en gel (PAGE) ha demostrado ser especialmente útil en el fraccionamiento de diversos grandes complejos multiproteicos 14-17. La combinación de la producción del proteasoma arqueas recombinante y PÁGINA desnaturalizante se ha convertido en un poderoso enfoque en dissecting ensamblaje proteasoma 9,11,12,18. Sin embargo, el método habitual por la que se aplica este enfoque (es decir. A través de la co-expresión recombinante de subunidades alfa y beta) tiene un inconveniente importante. Las reacciones de ensamblaje son cooperativas y fuertemente dependiente de la concentración 3. Dado que la concentración de proteínas dentro de las células es muy alta 19, debido a los efectos de volumen excluidos, reacciones de montaje se efectúen rápidamente in vivo. Por lo tanto es posible que se pierda importantes intermedios de montaje cuando se coexpresan alfa y beta subunidades.

Aquí, argumentamos a favor de un enfoque combinado en el estudio del conjunto de proteasoma utilizando subunidades del proteasoma arqueas recombinantes. En este enfoque, se emplean dos métodos de mezcla coexpression y lisado. El primero permite el análisis rápido de montaje debido a la coexpresión es menos mano de obra. Esta última depende de la expresión separada de alfa y beta subunidades, seguido de mezcla. Aunque este requires un poco más esfuerzo que la co-expresión, es más que compensada por la capacidad de detectar intermedios que se pierden durante la co-expresión. Juntos, estos dos métodos pueden proporcionar una imagen más completa del conjunto del proteasoma.

Protocol

1. Expresión bacteriana. Nota: Los plásmidos de expresión utilizados en este estudio se describen en la Tabla 1. Soluciones, los medios y tampones utilizados en este estudio se describen en la Tabla 2. La clonación de genes de la subunidad del proteasoma archaeal y la generación de plásmidos de expresión se describen en otro 18,20. En resumen, los plásmidos de coexpresión recombinante de subunidades emplean una estrategia o…

Representative Results

El montaje del proteasoma (Figura 1) comienza cuando subunidades se combinan para formar anillos 9. Esto se puede ilustrar cuando subunidades alfa de la archaeon Methanococcus maripaludis S2 se expresan en E. coli como C-terminal de hexahistidina marcado (marcado con His) derivados (Tabla 1). Cuando el α-su proteína recombinante se purificó por ICAR y se analizó por desnaturalizante PAGE, se observaron dos bandas (Figura 2A, carril 1). H…

Discussion

Se demuestra el beneficio de un enfoque combinado para analizar el montaje del proteosoma por nondenaturing PAGE utilizando proteasomas arqueas recombinantes. El método usual de 9,11 coexpresión bacteriana de subunidades del proteasoma permite el análisis rápido, pero puede no revelar montaje intermedios clave. Se aconseja la combinación de co-expresión con lisado de mezcla para desarrollar una visión más amplia de montaje de eventos.

La ventaja de este enfoque combinado e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención de apoyo Fondos de Investigación (RSFG) de la Universidad de Indiana-Purdue University, Indianapolis, y en parte por un premio de la Asociación Americana del Corazón 14GRNT20390154, a ARCA

Materials

Acrylamide (40%) solution Biorad 1610104 Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment
Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters EMDMillipore UFC501024
Ammonium persulfate Sigma A3678
ATP Sigma A7699
BCA assay kit Pierce 23225
Bisacrylamide (2%) solution Biorad 1610142
Bromophenol blue Sigma B8026
DNaseI Sigma DN25
Dithiothreitol (DTT) Thermo Fisher BP172
E.coli BL21 competent cells EMD Millipore 69450
GelCode Blue Thermo Fisher 24592 Colloidal coomassie stain reagent for gels
Gel doc EZ system Biorad 1708270 Gel documentation system
Gel releasers Biorad 1653320 Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid.
Glass rod Thermo Fisher 11-380B
Glycerol Sigma 49767
Glycine Thermo Fisher BP3865
Hamilton syringe Thermo Fisher 14-813-38 Glass syringe for loading gels
HEPES US Biologicals H2010
HMW Native calibration kit GE Healthcare 170445-01 High molecular weight protein standards
Hoefer SG30 Thermo Fisher 03-500-277 Gradient maker
Imidazole US Biologicals 280671
IPTG US Biologicals I8500 For induction of protein expression
Isopropanol Thermo Fisher BP26181
Kanamycin sulfate US Biologicals K0010
Lysozyme Sigma L6876
MgCl2 Fluka analytical 630680
Mini Protean Tetra Cell Biorad 1658002EDU Gel electrophoresis apparatus
NaCl Thermo Fisher S640-3
NaOH Thermo Fisher S318-1
Pefabloc SC Roche 11429876001 Protease inhibitor
pET42 EMD Millipore 70562 Expression plasmid
Precision plus all blue standard Biorad 1610373 Molecular protein standard for SDS-PAGE
Quickchange mutagenesis kit Agilent technologies 200521
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher BP166
Suc-LLVY-AMC Enzo lifesciences BML P802-0005 Fluorogenic substrate
Talon Metal Affinity Resin Clontech 635502 Immobilized-cobalt affinity resin
TEMED Sigma T7024
Tris US Biologicals T8600
Triton-X100 Sigma 93426
Tryptone Bacto BD 211699
UV sample tray Biorad 1708271 For UV imaging of gels
Yeast extract Bacto BD 212720

References

  1. Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
  2. Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
  3. Williamson, J. R. Cooperativity in macromolecular assembly. Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).
  4. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  5. Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
  6. Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
  7. Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
  8. Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
  9. Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. Critical elements in proteasome assembly. Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).
  10. Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
  11. Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
  12. Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
  13. Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
  14. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).
  15. Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
  16. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
  17. Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
  18. Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
  19. Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
  20. Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
  21. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  23. Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
  24. Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
  25. Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).

Play Video

Cite This Article
Panfair, D., Kusmierczyk, A. R. Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE: The Case for a Combined Approach. J. Vis. Exp. (118), e54860, doi:10.3791/54860 (2016).

View Video