El examen de la Asamblea proteasoma con recombinante arqueano Proteasomas y desnaturalizante PÁGINA: El Caso de un enfoque combinado

Complejos multiproteicos llevan a cabo numerosas actividades celulares críticas ^1. Para muchos de estos complejos, se sabe mucho más acerca de su estructura y la función de aproximadamente el ^2,3 de su montaje. El proteasoma es uno tan complejo y se encuentra en todos los ámbitos de la vida. En eucariotas, esta máquina molecular está en el núcleo del sistema de proteasoma / ubiquitina (UPS) y proporciona la principal vía de degradación de proteínas intracelulares ^4. El proteasoma eucariota (referido como el proteasoma 26S) se compone de dos conjuntos principales sub: un proteasoma 20S, o núcleo de la partícula (CP) ^5, que puede ser un tope en uno o ambos extremos por una partícula de regulación de 19S (RP) ^6.

El proteasoma 20S es un gran proteasa compartimentada. Su estructura cuaternaria se conserva absolutamente en todos los dominios de la vida y consiste en una pila de cuatro ciclos de siete miembros que contienen dos tipos de subunidades relacionadas estructuralmente, α; y ß ^5,7,8. En eucariotas, los dos anillos exteriores están cada uno compuesto de siete subunidades alfa diferentes y los dos anillos interiores están cada uno compuesto de siete subunidades beta distintas; actividad proteolítica reside dentro de tres de las subunidades beta. Por el contrario, los anillos Cp de arqueas y bacterias normalmente se componen de un solo tipo de α y un tipo de subunidad β. Proteasomas arqueas han proporcionado un importante sistema modelo para estudiar el montaje del proteasoma tanto por su simplicidad compositiva y su compartir un mecanismo de ensamblaje común con sus homólogos eucariotas ^9-13. En breve, las subunidades alfa ensamblan en anillos alfa primero, que sirven como un andamio sobre el que beta subunidades de montar. Las medias proteasomas resultantes (α ₇ β ₇₎ dimerize, dando lugar a ensamblados completamente CP (α β _{7 7 7} β α _7). Durante la dimerización, los propéptidos presentan en subunidades ßse eliminan autocatalítica, la exposición de las treoninas N-terminales catalíticos. El uso de proteasomas arqueas para modelar ensamblaje tiene con frecuencia las ventajas de la producción de proteínas recombinantes del proteasoma archaea en Escherichia coli. Este es un enfoque valioso porque permite a las subunidades que se producen en diversas combinaciones, ya que ambos WT y versiones mutantes, en un organismo huésped que no produce sus propios proteasomas.

El control de la asamblea de varios complejos de proteínas bioquímicamente requiere algún tipo de método de fraccionamiento que separa los complejos totalmente ensamblados de montaje intermedios y precursores. Debido a su capacidad de resolver superior, no desnaturalizante de poliacrilamida electroforesis en gel (PAGE) ha demostrado ser especialmente útil en el fraccionamiento de diversos grandes complejos multiproteicos ^14-17. La combinación de la producción del proteasoma arqueas recombinante y PÁGINA desnaturalizante se ha convertido en un poderoso enfoque en dissecting ensamblaje proteasoma ^9,11,12,18. Sin embargo, el método habitual por la que se aplica este enfoque (es decir. A través de la co-expresión recombinante de subunidades alfa y beta) tiene un inconveniente importante. Las reacciones de ensamblaje son cooperativas y fuertemente dependiente de la concentración ^3. Dado que la concentración de proteínas dentro de las células es muy alta ^19, debido a los efectos de volumen excluidos, reacciones de montaje se efectúen rápidamente in vivo. Por lo tanto es posible que se pierda importantes intermedios de montaje cuando se coexpresan alfa y beta subunidades.

Aquí, argumentamos a favor de un enfoque combinado en el estudio del conjunto de proteasoma utilizando subunidades del proteasoma arqueas recombinantes. En este enfoque, se emplean dos métodos de mezcla coexpression y lisado. El primero permite el análisis rápido de montaje debido a la coexpresión es menos mano de obra. Esta última depende de la expresión separada de alfa y beta subunidades, seguido de mezcla. Aunque este requires un poco más esfuerzo que la co-expresión, es más que compensada por la capacidad de detectar intermedios que se pierden durante la co-expresión. Juntos, estos dos métodos pueden proporcionar una imagen más completa del conjunto del proteasoma.