בחינת העצרת הפרוטאזום עם רקומביננטי Archaeal הפרוטאזומים ועמוד Nondenaturing: The Case for גישה משולבת
Summary
פרוטוקול זה משתמש בשני Coexpression למקטע ו למקטע postlysis ערבוב לבדיקה יסודית יותר של הרכבת הפרוטאזום רקומביננטי.
Abstract
הפרוטאזומים נמצאים בכל תחומי החיים. הם מספקים את המסלול העיקרי של פירוק חלבונים תאיים אאוקריוטים, אם כי הרכבה שלהם אינה מובנת לחלוטין. כל פרוטאזומים מכילים חלקיק הליבה נשמרת מבנית (CP), או הפרוטאזום 20S, המכיל שתי טבעות למקטע β heptameric דחוקה בין שתי טבעות למקטע α heptameric. פרוטאזומים 20S Archaeal פשוטים לעומת בעלי הרכב לעמיתיהם איקריוטיים שלהם, בעודם חולקים מנגנון הרכבה משותף. כתוצאה מכך, פרוטאזומים 20S archaeal להמשיך להיות מודל חשוב להרכבת הפרוטאזום איקריוטיים. באופן ספציפי, ביטוי רקומביננטי של פרוטאזומים 20S archaeal בשילוב עם ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide nondenaturing (עמוד) הניב תובנות חשובות רבות לתוך biogenesis הפרוטאזום. כאן, אנו דנים אמצעי לשפר את האסטרטגיה הרגילה של Coexpression של α הפרוטאזום archaeal ובטא יחידות משנה לפני nondenaturing עמוד. אנו מראים כי למרות מהירים ויעילים, גישת Coexpression לבדו יכולה לפספס ביניים הרכבת מפתח. במקרה של הפרוטאזום, Coexpression לא יכול לאפשר זיהוי של-הפרוטאזום וחצי, טבעת-α מלאה המכילה ביניים אחת β-טבעת אחד שלם. עם זאת, ביניים זו מזוהה בקלות באמצעות ערבוב lysate. אנו מציעים שילוב Coexpression עם ערבוב lysate מניב גישה יותר יסודית בניתוח הרכבה, עדיין נותר העבודה nonintensive. גישה זו עשויה להיות שימושית לחקר מתחמי multiprotein רקומביננטי אחרים.
Introduction
מתחמי multiprotein לבצע פעילות הסלולר קריטית רבה 1. עבור רבי קומפלקסים אלה, הרבה יותר ידוע על המבנה שלהם ותפקוד מאשר על ההרכבה שלהם 2,3. הפרוטאזום הוא מורכב אחד כזה והוא נמצא בכל תחומי החיים. אאוקריוטים, מכונה מולקולרית זה הוא הליבה של המערכת הפרוטסומית / יוביקוויטין (UPS) ומספק את המסלול העיקרי של פירוק חלבונים תאיים 4. הפרוטאזום איקריוטיים (המכונה הפרוטאזום 26s) מורכב משני מכלולים תת מרכזיים: א הפרוטאזום 20S, או חלקיקי Core (CP) 5, שניתן כתרים על קצוות אחד או שניהם על ידי חלקיק 19S תקין (RP) 6.
הפרוטאזום 20S הוא פרוטאז מידור גדול. המבנה הרביעון שלה נשמר לחלוטין בכל תחומי חיים והוא מורכב ערימה של ארבע טבעות שבע membered המכיל שני סוגים של יחידות משנה הקשורות מבני, α; ובטא 5,7,8. אאוקריוטים, שתי הטבעות החיצוניות כל מונה שבע יחידות משנת α ברורות ואת שתי הטבעות פנימיות כל מונה שבע יחידות משנת β ברורות; פעילות פרוטאוליטים מתגוררת בתוך שלוש של יחידות מהשנה β. לעומת זאת, טבעות CP של קדומים וחיידקים הן בדרך כלל מורכבות רק סוג אחד של α וסוג אחד של למקטע β. פרוטאזומים Archaeal סיפקו מערכת מודל חשוב ללמוד הרכבה הפרוטאזום הן בשל פשטות ההלחנה שלהם ושיתוף שלהם מנגנון הרכבה משותף עם עמיתיהם איקריוטיים שלהם 9-13. בקיצור, יחידות משנה α להרכיב לטבעות α ראשונה, אשר לשמש פיגום שעליו בטא יחידות משנה להרכיב. וכתוצאה מכך חצי פרוטאזומים (α 7 β 7) dimerize, והוליד התאספו מלא CP (α 7 β 7 β 7 α 7). במהלך dimerization, את propeptides להציג על יחידות משנה בטאיוסרו autocatalytically, חשיפת threonines N-terminal קטליטי. השימוש פרוטאזומים archaeal מודל הרכבה לעתים קרובות מנצל את הייצור של חלבונים הפרוטאזום archaeal רקומביננטי coli Escherichia. זוהי גישה כדאית משום שהוא מאפשר יחידות משנה להיות מיוצר בצירופים שונים, כמו גם WT וגרסאות מוטציה, בתוך הפונדקאי כי אינו מייצר פרוטאזומים משלה.
ניטור ההרכבה של קומפלקסי חלבונים רבים ביוכימית דורש סוג כלשהו של שיטת חלוקת המפריד מתחמים מורכבים במלואו מן ביניים ומבשרי הרכבה. בשל יכולת בפתרון מעולה, nondenaturing polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (עמוד) הוכיח להיות שימושי במיוחד החלוקה של מתחמי multiprotein גדולים השונים 14-17. השילוב של ייצור הפרוטאזום archaeal רקומביננטי עמוד nondenaturing הפכה גישה חזקה ב dissectinהפרוטאזום גרם הרכבת 9,11,12,18. עם זאת, השיטה הרגילה על ידי איזו גישה זו מיושמת (כלומר. דרך Coexpression רקומביננטי של יחידות משנת α ו β) יש חסרון חשוב. תגובות עצרת מאורגנות על בסיס שיתופיות וריכוז-תלוי מאוד 3. בהתחשב בכך את ריכוז החלבון בתוך התאים הוא גבוה מאוד 19, בשל תופעות נפח נשלל, תגובות הרכבה להמשיך במהירות in vivo. מכאן אפשר לפספס ביניים הרכבה חשובים כאשר יחידות משנת α ו β הן coexpressed.
כאן, אנו טוענים בגישה המשולבת במחקר של הרכבה הפרוטאזום באמצעות יחידות משנה הפרוטאזום archaeal רקומביננטי. לפי גישה זו, הן שיטות ערבוב Coexpression ו lysate מועסקים. הראשון מאפשר ניתוח מהיר של הרכבה כי Coexpression הוא פחות עבודה אינטנסיבית. זה האחרון תלוי ביטוי נפרד של תת-יחידות α ו β, ואחריו ערבוב. למרות requi זהמיל קצת יותר מאמץ מאשר Coexpression, זה בהחלט פיצו על ידי היכולת לזהות ביניים כי הם הפסידו במהלך Coexpression. יחד, שתי שיטות יכולות לספק תמונה שלמה יותר של הרכבה הפרוטאזום.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מדגימים את היתרון של גישה משולבת לניתוח הרכבה הפרוטאזום ידי nondenaturing עמוד באמצעות פרוטאזומים archaeal רקומביננטי. 9,11 השיטה הרגילה של Coexpression בקטריאלי של יחידות משנה הפרוטאזום מאפשר ניתוח מהיר אבל לא יכול לחשוף ביניים הרכבה מפתח. אנו מציעים שילוב Coexpression עם lysate ער…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק קרנות לתשתיות למחקר (RSFG) מאוניברסיטת אינדיאנה-Purdue University, אינדיאנפוליס, ובחלקה על ידי בפרס של איגוד הלב האמריקאי 14GRNT20390154, כדי ARK
Materials
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment |
| Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E.coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized-cobalt affinity resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson, J. R. Cooperativity in macromolecular assembly. Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
- Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
- Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
- Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
- Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. Critical elements in proteasome assembly. Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).
- Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
- Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
- Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
- Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).
- Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
- Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
- Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
- Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
- Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).
